Secuenciamiento específico de nueva generación para el diagnóstico molecular del Síndrome de Usher

Secuenciamiento específico de nueva generación para el  diagnóstico molecular del Sindrome de Usher

Orphanet Journal of Rare Diseases 2014, 9:168 doi:10.1186/s13023-014-0168-7 María J Aparisi (majoaparisi@gmail.com)

Elena Aller (elenaller@yahoo.es)

Carla Fuster-García (c.fustergarcia@gmail.com) Gema García-García (gema.garcia@inserm.fr) Regina Rodrigo (regina.rodrigo@yahoo.es)

Rafael P Vázquez-Manrique (rafael_vazquez@iislafe.es) Fiona Blanco-Kelly (FBlancoK@fjd.es)

Carmen Ayuso (cayuso@fjd.es)

Anne-Françoise Roux (anne-francoise.roux@inserm.fr) Teresa Jaijo (tjaijo@gmail.com)

José M Millán (millan_jos@gva.es)

 

 

 

 

 

ISS1750-1172

 

Tipo de Artículo  Publicación

 

Fecha de Presentación    19  Mayo  2014

 

Fecha de aceptación       27 Octubre 2014

 

Article URL http://www.ojrd.com/content/9/1/168

 

 

 

 

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Secuenciamiento específico de nueva generación para el diagnóstico molecular del Síndrome de Usher

 

María J Aparisi1,2

Email: majoaparisi@gmail.com

 

Elena Aller1,2

Email: elenaller@yahoo.es

 

Carla Fuster-García1

Email: c.fustergarcia@gmail.com

 

Gema García-García1,4

Email: gema.garcia@inserm.fr

 

Regina Rodrigo1,2

Email: regina.rodrigo@yahoo.es

 

Rafael P Vázquez-Manrique1,2 Email: rafael_vazquez@iislafe.es

 

Fiona Blanco-Kelly2,3 Email: FBlancoK@fjd.es

 

Carmen Ayuso2,3 Email: cayuso@fjd.es

 

Anne-Françoise Roux4

Email: anne-francoise.roux@inserm.fr

 

Teresa Jaijo1,2,†

Email: tjaijo@gmail.com

 

José M Millán1*,2,5,†

* Corresponding author Email: millan_jos@gva.es

 

  • Grupo de Investigación en Enfermedades Neurosensoriale Instituto de Investigación Sanitaria IIS-La Fe, Semisótano Escuela de Enfermería, Hospital Universitario La Fe, Avda. Campanar, 21, 46009 Valencia, Spain

 

  • CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER), Valencia, Spain

 

  • Servicio de Genética, IIS – Fundación Jiménez Díaz, University Hospital, UAM, Madrid, Spain

 

  • CHU Montpellier, Laboratoire de Génétique Moléculaire and Inserm, U827, Montpellier F-34000, France
  • Unidad de Genética y Diagnóstico Prenatal, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia, Spain

 

† Contribuidores a partes iguales.

 

Extracto

Antecedentes

El síndrome de Usher es una enfermedad autosómica recesiva que asocia pérdida de audición neurosensorial, retinitis pigmentosa y, en algunos casos, disfunción vestibular. Es clínica y genéticamente heterogénea. Hasta la fecha, se han asociado 10 genes con la enfermedad, haciendo que su diagnóstico molecular basado en la secuenciación de Sanger, sea caro y que consume mucho tiempo. En consecuencia, el objetivo del presente estudio fue desarrollar un método de diagnóstico molecular para el síndrome de Usher, basado en la secuenciación específca de nueva generación de destino.

 

Métodos

Se diseñó un panel personalizado HaloPlex para plataformas Illumina para capturar todos los exones de los 10 genes conocidos causantes de síndrome de Usher (MYO7A, USH1C, CDH23, PCDH15, USH1G, CIB2, USH2A, GPR98, DFNB31 y Clarina-1), los dos Usher genes relacionados con el síndrome (HARS y PDZD7) y los dos genes candidatos VEZT y MYO15A. Una cohorte de 44 pacientes que sufren de síndrome de Usher fue seleccionado para este estudio. Esta cohorte se dividió en dos grupos: un grupo de prueba de 11 pacientes con mutaciones conocidas y otro grupo de 33 pacientes con mutaciones desconocidas.

Resultados

Cuarenta pacientes USH fueron secuenciados con éxito, 8 USH pacientes del grupo de prueba y 32 pacientes del grupo compuesto por pacientes USH sin diagnóstico genético. Hemos sido capaces de detectar mutaciones bialélicas en un gen USH en 22 de 32 pacientes (USH 68,75%) e identificar el 79,7% de los alelos mutados esperados. Se detectaron Cincuenta y tres mutaciones diferentes. Estas mutaciones incluyen 21 mutaciones sustitutiva, 8 mutaciones sin sentido, 9 mutaciones con desplazamiento, 9 intrónicas y 6 grandes reordenamientos.

Conclusiones

La secuenciación específica de nueva generación nos permitió detectar dos mutaciones puntuales y grandes reordenamientos en un solo experimento, minimizando el coste económico del estudio, el aumento de la ratio de detección de la causa genética de la enfermedad y mejorar el diagnóstico genético de los pacientes con síndrome de Usher.

Palabras clave

El síndrome de Usher, el diagnóstico molecular, Secuenciamiento de nueva generación, mutaciones puntuales, grandes reordenamientos.

 

Antecedentes

El síndrome de Usher (USH) es una enfermedad autosómica recesiva caracterizada por la asociación de la pérdida de audición neurosensorial, retinitis pigmentosa (RP) y, en algunos casos, la disfunción vestibular. Su rango de prevalencia es 3-6,2 por 100.000 [1-3] y es la forma más común de los síndromes hereditarios que combinan la pérdida de audición y retinitis pigmentosa.

USH tiene una heterogeneidad clínica y genética notable. Según la gravedad y la progresión de la enfermedad, se dintinguen tres tipos clínicos. Tipo I (USH1) se define por una profunda pérdida de audición congénita, inicio de la RP por lo general dentro de la primera década de la vida y ausencia de función vestibular. Los pacientes con síndrome de Usher tipo II (USH2) presentan pérdida auditiva moderada-severa congénita, inicio de la RP alrededor o después de la pubertad y función vestibular normal. El síndrome de Usher tipo III (USH3) se caracteriza por la pérdida progresiva de la audición postlingual, RP con una edad variable de aparición y respuesta vestibular variable [4]). Sin embargo, en algunos pacientes la enfermedad no encaja en ningun de estos tres subtipos, y se clasifican como “síndrome de Usher atípico”.

Hasta la fecha, 10 genes y tres loci adicionales se han asociado con la enfermedad. Para USH1 se han identificado seis genes: MYO7A (USH1B), USH1C (USH1C), CDH23 (USH1D), PCDH15 (USH1F), USH1G (USH1G) y CIB2 (USH1J); y se han descrito dos loci adicionales: USH1E [5] y USH1H [6]. Se han encontrado tres genes causantes de USH2: USH2A (USH2A), GPR98 (USH2C) y DFNB31 (USH2D). Para USH3 sólo se han descrito las mutaciones de CLRN1, y se propuso un segundo locus, USH3B. Además, la mayoría de estos genes son también responsables de la pérdida auditiva no sindrómica o aislada RP [4,7].

Además de estos 10 genes, otros tres genes se han asociado con USH. PDZD7 se propuso como un colaborador de la herencia digénica con GPR98, y como modificador de la enfermedad de la retina en pacientes USH2A [8]. Recientemente, una nueva variante de mutación sustititiva bialélica bialélico en HARS se identificó en dos pacientes con un fenotipo compatible con USH3. Este gen que codifica una sintetasa aminoacil tRNA se propuso como un nuevo gen causante de USH3 [9]. Más recientemente, CEP250 se ha asociado con el síndrome de Usher atípico [10].

Las proteínas codificadas por los genes Usher pertenecen a clases diferentes: proteína motora asociada a la actina, proteína de andamiaje, moléculas de adhesión celular o proteínas transmembrana, algunas de ellas con grandes dominios extracelulares. Estas proteínas a través de sus dominios de interacción proteína-proteína están integrados en una red conocida como “Usher-interactome”. Los principales sitios de colocalización de proteínas Usher son los estereocilios o haz de pelo de las células ciliadas del oído interno, y las zonas sinápticas y periciliares de los fotorreceptores [4,11].

En los estereocilios, dos redes diferentes de proteínas USH son conocidos por estar involucrados en el desarrollo y mantenimiento de las células pilosas del oído interno. Uno de ellos está compuesto por las proteínas USH2, miosina VIIA (codificada por MYO7A), Vezatin y PDZD7 [12,13]. Vezatin está codificada por VEZT y se requiere para la resistencia al sonido de las células ciliadas cocleares. Además, se ha sugerido que está implicado en las etapas de maduración de estas células o en el mantenimiento de la integridad de unión entre las células pilosas y las células de soporte en el oído interno [14]. El segundo estereocilio interactome se compone de las proteínas USH1 [15]. En esta red también se han encontrado algunas miosinas no convencionales, como XVa miosina, [16-18]. Las mutaciones en MYO15A, el gen que codifica la miosina XV bis, son responsables de la pérdida auditiva no sindrómica autosómica recesiva DFNB3 [19]. Además, miosina XV bis interactúa con la whirlina en la esterocilia, considerado un acontecimiento clave en la morfogénesis de haz de pelo [20], y esta interacción directa en la punta estereocilios es probable que controle la elongación de los estereocilios [21].

En la retina, también se han descrito dos redes moleculares similares compuestas de proteínas USH2 y USH1. La red de proteínas USH2, localizada en la región del complejo de la cresta periciliar, contribuye a la trata de cargas que se mueven desde el segmento interior al segmento exterior de las células fotorreceptoras a través del cilio de conexión. Se sabe que el interactome USH1 se situa en la conexión membrana-membrana entre el segmento exterior de las células fotorreceptoras y los procesos calyceal en primates. Este complejo de proteínas USH1 se cree que forman un cinturón de adhesión y podría contribuir a la renovación diaria de los segmentos externos de los fotorreceptores [22-24].

Tradicionalmente, el diagnóstico molecular del síndrome de Usher se ha basado principalmente en la secuenciación de Sanger [25,26]. Sin embargo, el gran tamaño de la mayoría de genes USH (por encima de 350 exones en total) hace que esta técnica sea costosa y larga. El screening de mutaciones basadas en matrices (tecnología de extensión del cebador dispuestos (APEX)) se ha convertido en una técnica rápida y eficaz para detectar las mutaciones descritas anteriormente, y se ha desarrolado un APEX-microarray específico para USH [26]. Sin embargo, la mayoría de las mutaciones USH son privadas, por lo que la baja tasa de detección de la APEX-microarrays para el síndrome de Usher obstaculiza el uso de esta tecnología [27,28]. Además, Copy Number Variants (CNV) se han identificado como una causa importante de la enfermedad en el síndrome de Usher. Las supresiones y duplicaciones se examinan con Multiplex Ligadura-dependiente de la sonda de amplificación (MLPA), para lo cual sólo se dispone de probemix comercial para USH2A y PCDH15, o Hibridación Genómica Comparada (CGH a-) [29-31].

En los últimos años, las técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS) se han desarrollado aún más, permitiendo que el genoma completo, el exoma completa y la secuenciación específica de genes sea más viable, y por lo tanto haciendo la identificación de genes enfermos y de las mutaciones subyacentes más fácil, rápida y rentable. La mejora de NGS es especialmente útil en el diagnóstico de enfermedades genéticamente heterogéneas, tales como pérdida de audición o distrofias retinianas [32-35].

Para el síndrome de Usher, se han desarrollado varios métodos de NGS. Licastro et al. [36] utilizó dos enfoques diferentes: la secuenciación del exoma completo con el uso del sistema SOLiD y secuenciación long-PCR de nueve genes USH con dos plataformas diferentes, Illumina (Genome Analyzer II) y Roche 454 (GS FLX). Recientemente, Besnard et al. [37] desarrolló una aproximación NGS específica. Incluyeron 9 genes USH, 2 genes candidato USH (VEZT y PDZD7), siete genes con pérdida de audición y el gen causante de choroideremia CHM. La secuenciación se llevó a cabo en un secuenciador Roche GS Júnior secuenciador. Yoshimura et al. [38] también ha aplicado una metodología de secuenciación masiva paralela de ADN, pero sólo para los pacientes USH1. Recientemente, Rong W et al. [39] utiliza el enfoque  NGS para identificar tres nuevos alelos y una mutación conocida en MYO7A en tres familias chinas.

Hemos desarrollado un diagnóstico molecular del síndrome de Usher basado en una técnica específica NGS, HaloPlex (Agilent) el enriquecimiento de genes objetivo para plataformas Illumina, incluyendo los diez genes USH conocidos y cuatro genes candidatos que nos permitió identificar no sólo las mutaciones puntuales, sino también CNV, la implementación una plataforma para el diagnóstico genético de esta enfermedad.

 

 

Métodos

Pacientes

Se seleccionó para este estudio una cohorte de 44 pacientes con diagnóstico de síndrome de Usher. Se realizó su clasificación clínica en USH1, USH2, USH3 o atípico USH en base a su historial clínico y oftalmológico, audiometría y pruebas vestibulares. Los pacientes incluidos en este trabajo se dividieron en dos grupos: un grupo de prueba y un grupo compuesto por los pacientes USH sin diagnóstico genético.

Siempre que fue posible, se utilizaron muestras de otros miembros de la familia para llevar a cabo análisis de segregación de la secuencia de las variantes identificadas en el paciente-caso.

Todos los pacientes y familiares incluidos en el presente estudio firmaron su consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por el consejo institucional del Comité de Ética del Hospital Universitario La Fe.

Grupo de prueba

El grupo de prueba estaba formaron por 11 pacientes: cinco USH1, cuatro USH2, uno USH3 y uno USH atípico. Estos pacientes habían sido seleccionados utilizando una combinación de técnicas como la secuenciación de Sanger, APEX microarray para el síndrome de Usher o MLPA. Las variantes de distinta naturaleza en seis genes USH se habían detectado previamente y fueron utilizadas como controles positivos en el presente estudio. La Tabla 1 muestra los cambios previamente identificados en el grupo de prueba.

Patient Clinical type Gene Type variant Nucleotide Protein Classification
RP-808 USH1 CDH23 Intronic c.6059-9G > A —– Pathogenic. UV4
    USH1G Missense c.387A > G p.Lys130Glu UV1
    USH1G Missense c.423G > A p.Glu142Lys UV2
RP-1145 USH2 USH2A Frameshift duplication c.10272-10274dup p.Cys3425Phefs*4 Pathogenic. UV4
    USH2A Nonsense c.7854G > A p.Trp2618* Pathogenic. UV4
 

RP-1286§

 

USH1

DFNB31 PCDH15 Isocoding Frameshift insertion c.117G > A

c.1304_1305insC

p.Val39Val p.Thr436Tyrfs*12 UV1

Pathogenic. UV4

RP-1374 USH1 PCDH15 Nonsense c.7C > T p.Arg3* Pathogenic. UV4
RP-1426 USH1 MYO7A Missense c.6610G > C p.Ala2204Pro Pathogenic
RP-1522 USH2 USH2A Frameshift deletion c.2299delG p.Glu767Serfs*21 Pathogenic. UV4
 

RP-1608§

 

USH3

CDH23 USH2A Missense Missense c.1096G > A c.9799 T > C p.Ala366Thr p.Cys3267Arg UV2

Pathogenic. UV4

RP-1614 USH1 MYO7A Frameshift deletion c.6025delG p.Ala2009Profs*32 Pathogenic. UV4
RP-1637 USH2 USH2A Frameshift duplication c.5540dupA p.Asn1848Glufs*20 Pathogenic. UV4
 

RP-1757§

 

Atypical

USH2A MYO7A Large deletion

In-frame deletion

Del IVS4_IVS9

c.655_660del

p.Gly262Valfs*2 p.Ile219_His220del Pathogenic. UV4 Pathogenic. UV4
RP-1760 USH2 USH2A Missense c.2296 T > C p.Cys766Arg UV3

 

Tabla 1 Grupo de prueba: pacientes portadores de variantes de secuencia genes USH previamente detectado                                                                                                                                                          

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Las muestras que fallan en el proceso de amplificación están marcadas con §.

 

Cohorte de pacientes USH no cribados previamente

Una cohorte de 33 USH pacientes sin diagnóstico genético se inscribieron en este estudio. Se compone de 13 pacientes, 17 USH1 USH2 y 3 USH3 casos.

 

Muestras de ADN

El ADN genómico de los pacientes y familiares se extrajo de sangre EDTA usando un extractor automático de ADN (Magna Pure, Roche). Las muestras de ADN se purificaron con el “kit de purificación PCR QIAqick” siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración del ADN genómico se determinó con el “Kit de ensayo Qubit dsDNA BR” en el fluorómetro Qubit 2.0.

Diseño de la secuenciación específica de nueva generación

Se diseñó un panel HaloPlex costumbre usando la herramienta SureDesign de Agilent (www.agilent.com/genomics/suredesign) para capturar todos los exones y 25 pb de las regiones intrónicas laterales de 14 genes. Los genes específicos que figuran en nuestro trabajo fueron los 10 causantes de síndrome de Usher genes (MYO7A, USH1C, CDH23, PCDH15, USH1G, CIB2, USH2A, GPR98, DFNB31 y CLRN-1), dos genes afines USH (HARS y PDZD7) y dos genes candidatos VEZT y MYO15A, debido a su participación en el interactome Usher [14,20,21]. El innovador CEP250 [10] no se había asociado con USH al comienzo de este estudio, por lo que no se incluyó en nuestro trabajo.

El diseño personalizado de todo era 481 objetivos con un tamaño total de 132.763 Kb. Los exones de las diferentes isoformas incluidos en este estudio se resumen en la Tabla 2. La región intrónica donde se encuentra la mutación USH2A c.7595-2144A> G [37], se incluyó en el diseño. El tamaño final de diseño de la sonda era 296.74 Kb con una cobertura teórica de 99,88% para nuestras regiones seleccionadas. La diferencia de tamaño entre todo nuestro diseño personalizado y el diseño de la sonda final se debió a un proceso intrínseco de la ingeniería de sondas por la herramienta Sure Design de Agilent para el protocolo HaloPlex.

 

 

 

 

     Table 2 Detalles de los exons studiados in este analisis NGS específico para los 14 genes analizados              

Chr Gene RefSec Coding exons Size (bp) Coding Size (bp) Amino acids Alternative Ref Sec Additional exons and the intronic

USH2A region included in the study

Size (bp) Number of exons analyzed
11 MYO7A NM_000260.3 variant 1 48 7465 6648 2215       48
10 CDH23 NM_022124.5 variant 1 69 11134 10065 3354 NM_052836.3 variant 2 1 150 70
10 PCDH15 NM_033056.3 variant C 32 7021 5868 1955 NM_001142773.1 variant H 1 6 38
              NM_001142769.1 variant I 2 871  
              NM_001142771.1 variant K 2 4469  
11 USH1C NM_153676 variant 3 27 3246 2700 899 NM_005709.3 variant 1 1 75 28
17 USH1G NM_173477.4 variant 1 3 3565 1386 461       3
15 CIB2 NM_006383.2 variant 1 6 1580 564 187       6
1 USH2A NM_206933.2 variant 2 71 18883 15609 5202 NC_000001.11 c.7595-2144A > G 152 71 + 1 intronic sequence
5 GPR98 NM_032119.3 variant 1 90 19333 18921 6307       90
9 DFNB31 NM_015404.3 variant 1 12 4079 2724 907 NM_001083885.2 variant 2 1 110 13
3 CLRN1 NM_174878.2 variant 1 3 2359 699 232 NM_052995.2 variant 4 1 20 4
10 PDZD7 NM_001195263.1 variant 1 17 4164 3102 1033 NM_024895.4 variant 2 1 285 18
5 HARS NM_002109.5 variant1 13 2322 1530 509       13
17 MYO15A NM_016239.3 65 11876 10593 3530       65
12 VEZT NM_017599 variant 1 12 4580 2340 779 NR_038242.1 variant 2 1 74 13
Total targets                   481

 

Captura de secuencias y la secuenciación de nueva generación

La captura de la secuencia se realizó de acuerdo con el ” Sistema HaloPlex de enriquecimiento específico” (Versión de protocolo D.5, Agilent Technologies Inc, CA, EE.UU.) para secuenciación Illumina. Entre 225 y 450 ng de gDNA fueron digeridos por 16 enzimas de restricción diferentes para crear una colección de fragmentos de restricción gDNA. Cuatro series 12-reacción se llevaron a cabo incluyendo en cada una de ellos 11 muestras gDNA y una muestra de ADN de control de enriquecido. Estas digestiones enzimáticas fueron validadas por un análisis electroforético en un gel de poliacrilamida. Los fragmentos de restricción gDNA se hibridaron a la serie de captura de sonda HaloPlex. En este paso, los diseños de secuenciación Illumina incluyendo secuencias de índice se incorporaron en los fragmentos específicos y la sonda híbrida HaloPlex-ADN se redondeó. Estas moléculas híbridas fueron capturadas utilizando perlas de estreptavidina. A continuación se añadió la ligasa de ADN para cerrar las mellas en la de sonda híbrida específica redondeada ADN- HaloPlex y las series de ADN capturadas se evitaron con NaOH.

Se realizó una amplificación por PCR de las series específicas capturadas siguiendo las instrucciones del fabricante y, después de su purificación con las “cuentas AMPure XP” (Beckman CULTER Inc), la validación y cuantificación del ADN específico enriquecido en cada serie se realizó usando el 2100 Bioanalyzer sistema con el Kit de ADN de alta sensibilidad y el software de 2100 Expert (Agilent Technologies Inc, CA, EE.UU.). El último paso del protocolo fue juntar las muestras para la secuenciación de multiplexado en la plataforma de secuenciación de Illumina MiSeq (Sistem Illumina, Inc).

Análisis de Variantes

Los datos se analizaron utilizando la plataforma proporcionada por DNAnexus (www.dnanexus.com). Se utilizaron dos versiones diferentes: DNAnexus Classic y la versión DNAnexus implementada recientemente. Las variantes anotadas se seleccionaron de acuerdo a los siguientes criterios: valor de la calidad ≥250, porcentaje de heterocigosidad de las lecturas ≥30%, su anotación en el dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP ) y su descripción en la base de datos de mutación de síndrome de Usher https://grenada.lumc.nl/LOVD2/Usher_montpellier). Las variantes se deben observar en ambas cadenas directas e inversas.

Las variantes seleccionadas y sospechosas de ser patógenas se confirmaron por secuenciación Sanger. Los fragmentos de ADN que contienen las variantes se amplificaron por PCR con cebadores específicos y se secuenciaron en ambas cadenas utilizando el Big Dye Terminator Sequencing Kit 3.1. Los productos de secuencia purificados se analizaron en un instrumento ABI 3500XL (Applied Biosystems por Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Inc).

La patogenicidad de nuevas variantes de mutación sustitutiva se analizó con los algoritmos SIFT (http: star.edu.sg/ //sift.bii.a-) y PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/). Esas variantes supuestas que afectan el proceso de empalme se estudiaron con los programas NetGene2 (http://www.cbs.dtu.dk/service/NetGene2), NNSPLICE v0.9 http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice. html), Human Splicing Finder (HSF; http://www.umd.be/HSF) y RESCATE-ESE (http://genes.mit.edu/burgelab/rescue-ese/)

Se clasificaron nuevas variantes en base al sistema de clasificación de variantes desconocidas (UV) (https://grenada.lumc.nl/LOVD2/Usher_montpellier) como patógena (UV4), posiblemente patógena (UV3), posiblemente no patógena (posiblemente neutral, UV2) y no patógena (neutral, UV1) de acuerdo con las predicciones bioinformáticas y el análisis de segregación. Esta clasificación está en línea con las directrices publicadas por la sociedad de genética clínica y molecular (http://www.cmgs.org/BPGs/Best_Practice_Guidelines.htm).

La nomenclatura de las variantes se realizó de acuerdo a las secuencias de referencia: MYO7A (NM_000260.3), USH1C (NM_153676), CDH23 (NM_022124.5), PCDH15 (NM_033056.3), USH1G (NM_173477), CIB2 (NM_006383.2), USH2A (NM_206933), GPR98 (NM_032119.3), DFNB31 (NM_015404), CLRN1 (NM_174878), HARS (NM_002109), PDZD7 (NM_001195263.1), VEZT (NM_017599) y MYO15A (NM_016239).

El análisis de segregación análisis se llevó a cabo en los casos en que se disponía de muestras de ADN de familiares.

Análisis y validación de la variación del número de copias
La cobertura de cada región específica de la muestra de interés se normalizó y se compara con datos de media normalizada de todas las otras muestras de la misma pasada para obtener el alcance de la proporción relativa. Se sospechó que las supresiones y duplicaciones estaban presentes si esta proporción caía por debajo de 0,7 o subía por encima de 1,3, respectivamente.

La validación de los reordenamientos de USH2A y PCDH15 se realizó por análisis MLPA. Para USH2A se utilizaron los probemixes SALSA MLPA P361 y P362. Para confirmar las variaciones del número de copia PCDH15 se empleó SALSA MLPA probemix P292. Las reacciones de MLPA se realizaron de acuerdo a las recomendaciones del fabricante (http://www.mlpa.com).

En los casos de supuestos reordenamientos identificados en CDH23 y GPR98, su validación se llevó a cabo con oligonucleótido array-CGH. El chip array -CGH incluyó 77.366 sondas que cubrieron los genes MYO7A, CDH23, PCDH15, USH1C, USH1G, USH2A, GPR98, DFNB31,
PDZD7 y CLRN1 y 10.000 nucleótidos de las regiones sin interpretar 5 ‘y 3′ [30].

Resultados

Resultados de la secuenciación de próxima generación del panel USH

La captura de NGS utilizando nuestro panel USH personalizada se llevó a cabo en una cohorte de pacientes USH. Se obtuvieron resultados de alta calidad. En promedio, una cobertura media de 1334x se obtuvo por muestra y región específica. Se obtuvieron diferentes coberturas promedio para los catorce genes analizados, que van desde 935x (VEZT) a 1817x (CLRN1) (Figura 1).

Figura 1 Cobertura media obtenida para los diferentes genes. La línea azul muestra el límite inferior de la cobertura adecuada para llevar a cabo análisis CNV (250x).

Sólo una de las regiones específicas seleccionadas mostraron una cobertura inferior a 40x, el límite definido para la validación adecuada y procedimientos de diagnóstico. Este objetivo era una región de codificación de 43 pb en el exón 2 de MYO15A. Se muestra una representación esquemática de la cobertura de todas las regiones diana en la Figura 2.

Figura 2 Cobertura media de todas las regiones específicas incluidas en nuestro diseño personalizado.

Grupo de ensayo: la validación de la estrategia diagnóstica

Se incluyeron once pacientes USH en el grupo de prueba para verificar la fiabilidad de nuestro panel personalizado NGS. En estos casos, se habían detectado previamente 17 mutaciones y polimorfismos en diferentes genes USH por Sanger o por MLPA (Tabla 1).

Durante el ensayo los tres pacientes de control y un paciente estudiado fallaron en la etapa de captura del ADN específico del protocolo HaloPlex. Debido a un problema manual/técnico con las tiras PCR y el bastidor magnético Dynabeads, los híbridos sonda específicos de ADN-HaloPlex redondeados, que contienen biotina, no se capturaron en perlas de estreptavidina y se perdieron estas muestras.

Los ocho pacientes restantes eran portadores de 14 variantes diferentes, incluyendo sustitutiva, sin sentido, supresión de puntos o inserciones y supresiones grandes (Tabla 1). Nuestro enfoque NGS nos permitió detectar todos los cambios previamente detectados en la cohorte de prueba, tanto mutaciones puntuales como CNV.

La secuenciación de los genes USH permitió la detección de un segundo alelo patológico en cinco pacientes en los que se solo se había detectado antes una mutación. Además, en el paciente RP-1426, anteriormente portador de una variante patógena en MYO7A, hemos sido capaces de identificar una nueva mutación del sitio de empalme en CDH23. Estos resultados se resumen en la Tabla 3.

 

 

 

Patient Clinical type Gene Exon Nucleotide variant Protein variant Reference                                                         Segregation ana
Patients with two pathogenic mutations in the same gene
RP-807 USH2 MYO7A 40 c.5516 T > C p.Leu1839Pro Novel. UV3 Yes
    MYO7A 27 c.3503G > A p.Arg1168Gln Novel. UV3  
RP-808¶ USH1 CDH23 47 c.6059-9G > A von Brederlow et al., (2002) [40] No
    CDH23 10 c.871G > A p.Gly291Arg Novel. UV3  
RP-890 USH3 USH2A 26 c.5278delG p.Asp1760Metfs*10 Garcia-Garcia et al., (2011) [41] No
    USH2A 26 c.5278delG p.Asp1760Metfs*10 Garcia-Garcia et al., (2011) [41]  
RP-1182 USH1 PCDH15 22_23 Duplication exons 22_23 Novel. UV4 No
    PCDH15 22_23 Duplication exons 22_23 Novel. UV4  
RP-1183 USH1 CDH23 26 c.3016G > A p.Glu1006Lys Schultz et al., (2011) [42] No
    CDH23 26 c.3016G > A p.Glu1006Lys Schultz et al., (2011) [42]  
RP-1234 USH1 MYO7A 43 c.5884delTTCT p.Phe1962Leufs*7 Novel. UV4 Yes
    MYO7A 43 c.5884delTTCT p.Phe1962Leufs*7 Novel. UV4  
RP-1237 USH1 CDH23 46 c.6049G > A p.Gly2017Ser Roux et al., (2006) [43] No
    CDH23 46 c.6049G > A p.Gly2017Ser Roux et al., (2006) [43]  
RP-1374¶ USH1 PCDH15 2 c.7C > T p.Arg3* Ahmed et al., (2001) [44] Yes
    PCDH15 27 c.3717 + 2dupT Jaijo et al., (2012) [45]  
RP-1422 USH1 MYO7A 43 c.5944G > A p.Gly1982Arg Riazuddin et al., (2008) [46] Yes
    MYO7A 43 c.5944G > A p.Gly1982Arg Riazuddin et al., (2008) [46]  
RP-1522¶ USH2 USH2A 13 c.2299delG p.Glu767Serfs*21 Liu et al., (1999) [47] No
    USH2A 20 Deletion exon 20 Novel. UV4  
RP-1551 USH1 PCDH15 27 c.3511delA p.Asp1172Ilefs*13 Novel. UV4 Yes
    PCDH15 27 c.3511delA p.Asp1172Ilefs*13 Novel. UV4  
RP-1614¶ USH1 MYO7A 44 c.6025delG p.Ala2009Profs*32 Bharadwaj et al., (2000) [48] No
    MYO7A 40 c.5537C > A p.Pro1846His Novel. UV3  
RP-1760¶ USH2 USH2A 55 c.10888delA p.Gly3631Valfs*43 Novel. UV4 No
    USH2A 13 c.2296 T > C p.Cys766Arg Glöcke et al., (2013) [35]  
RP-1781 USH2 CDH23 29 Duplication exon 29 Novel. UV4 No
    CDH23 68 c.9569C > T p.Ala3190Val Novel. UV3  
RP-1791 USH1 MYO7A 20 c.2283-1G > T Roux et al., (2006) [43] Yes
    MYO7A 28 c.3594C > A p.Cys1198* Roux et al., (2011) [43]  
RP-1802 USH2 USH2A 63 c.13811 + 2 T > G Besnard et al., (2014) [37] No
    USH2A 50 c.9799 T > C p.Cys3267Arg Aller et al., (2006) [49]  
RP-1835 USH2 USH2A 57 c.11065C > T p.Arg3689* Le Quesne Stabej et al., 2012[50] Yes

 

Table 3 Mutaciones causantes y variantes presuntas patógenas identificadas en este estudio                              

lysis

 

 

  USH2A 22 c.4758 + 3A > G Novel. UV3  
RP-1864 USH2 MYO7A 6 c.494C > T p.Thr165Met Ouyang et al., (2005) [51] No
    MYO7A 6 c.494C > T p.Thr165Met Ouyang et al., (2005) [51]  
RP-1895 USH2 GPR98 79_83 Duplication exons 79_83 Besnard et al., (2012) [52] No
    GPR98 79_83 Duplication exons 79_83 Besnard et al., (2012) [52]  
RP-1904 USH2 GPR98 11 c.2145_2149delGTTTT p.Leu715Phefs*6 Novel. UV4 Yes
    GPR98 14 c.2612delG p.Gly871Glufs*8 Novel. UV4  
RP-1910 USH1 CDH23 60 c.8722 + 1delG Oshima et al., (2008) [53] Yes
    CDH23 60 c.8722 + 1delG Oshima et al., (2008) [53]  
RP-1924 USH1 MYO7A 39 c.5392C > T p.Gln1798* Janecke et al., (1999) [54] Yes
    MYO7A 27 c.3503G > A p.Arg1168Gln Novel. UV3  
RP-1927 USH2 USH2A 21 c.4474G > T p.Glu1492* Bernal et al., (2005) [55] Yes
    USH2A 2 c.269A > G p.Tyr90Cys Novel. UV3  
RP-1948 USH1 MYO7A 7 C.707 T > A p.Leu236Gln Novel. UV3 No
    MYO7A 42 c.5749G > T p.Glu1917* Jacobson et al., (2009) [56]  
RP-1960 USH2 USH2A 25 c.5167G > C p.Gly1723Arg Novel. UV3 No
    USH2A 7 c.1214delA p.Asn405Ilefs*3 Bernal et al., (2005) [55]  
Patients with three pathogenic mutations in two different genes
RP-1847 USH2 USH2A 62 c.12067-2A > C Kaiserman et al., (2007) [57] Yes
    USH2A 14 Deletion exon 14 Glöckle et al., (2013) [35]  
    USH1G 2 c.805C > T p.Arg269X Novel. UV4  
RP-1923 USH2 USH2A 62 c.12093delC p.Tyr4031* Garcia-Garcia et al., (2011) [41] No
    USH2A 44 Deletion exon 44 Glöckle et al., (2013) [35]  
    DFNB31 9 c.2234G > A p.Arg745His Novel. UV3  
Patients with only one pathogenic mutation
RP-1455 USH1 USH2A 28 c.5666A > G p.Asp1889Gly Novel. UV3 No
RP-1496 USH3 GPR98 19 c.3443G > A p.Gly1148Asp Novel. UV3 No
RP-1741 USH2 USH2A PE40 c.7592-2144A > G Vaché et al., (2012) [58] No
RP-1929 USH2 GPR98 58 c.11974G > A p.Asp3992Asn Novel. UV3 No
RP-1953 USH2 USH1C 18 c.1859G > T p.Arg620Leu Ouyang et al., (2002) [59] No
Patients with pathologic mutations in different genes
RP-1426¶ USH1 MYO7A 49 c.6610G > C p.Ala2204Pro Jaijo et al., (2007) [60] Yes
    CDH23 39 c.5068-2A > T Novel. UV4  
RP-1950 USH2 USH2A 70 c.2299delG p.Glu767Serfs*21 Liu et al., (1999) [47] No
    GPR98 70 c.14278C > T p.Pro4760Ser Novel. UV3  

Los patientes previamente incluidos en el grupo de ensayo  están marcados con ¶.

Las nuevas variantes se marcan en negrita.

PE: Pseudoexon 40.

 

Cohorte de pacientes USH previamente no cribados

En nuestra cohorte de 33 pacientes estudiados USH, mutaciones podrían ser identificadas en la mayoría de los casos analizados. Uno de los casos USH fracasaron en la captura y la amplificación de la biblioteca debido a la misma manual de error / técnica explicado anteriormente. Si tenemos en cuenta las restantes 32 USH casos analizados, se identificaron en 22 pacientes de los dos alelos mutados esperados, en 5 casos sólo una variante patógena y en un caso, RP-1950, se detectaron dos variantes patogénicas en dos genes USH2 diferentes. En cuatro pacientes no se encontró una mutación. Además, dos pacientes (RP-1847 y RP-1923) eran portadores de mutaciones en tres genes USH (Tabla 3).

En este estudio, hemos sido capaces de identificar 53 mutaciones diferentes, de los cuales 24 fueron novela. Estas variantes incluyen 21 missense, 8 tonterías, 9 frameshifts, 9 mutaciones intrónicas y 6 grandes reordenamientos.

El programa nexo de ADN mostró un alto número de nuevas variantes en cada paciente. Estos cambios se seleccionaron de acuerdo a su naturaleza, o la presencia de otro alelo patógeno en el mismo gen en el mismo paciente. Las variantes se confirmaron por secuenciación Sanger y las variantes sustitutiva, isocodificante o intrónicas se analizaron por diferentes algoritmos in silico para predecir su efecto patógeno. De acuerdo con las predicciones bioinformáticas, 15 variantes de cada 25 variantes estudiadas fueron consideradas como patógenas (UV4) o posiblemente patógena (UV3) (Tabla 4).

 

 

 

 

Table 4 Resumen de supuestas mutaciones patógenas y sus predicciones bioinformáticas

 

Patient         Gene     Exon     Nucleotide

Change

Amino Acid Change

Classification    SIFT (score)     PolyPhen-2 (score)                NetGene2                                  Human Splicing Finder

NNSPLICE            RESCUE-ESE

 

RP-1948    MYO7A      7         c.707T>A       p.Leu236Gln           UV3           deleterious (0)       probably_damaging (1)                       Neutral                  Neutral       Neutral                      A new ESE site is

created

 

RP-807 RP- 1924

MYO7A     27       c.3503G>A    p.Arg1168Gln          UV3           deleterious (0)       probably_damaging (1)        Score for the main donor site

decreases from 95 to 75

Score for the main donor site decreases from 90 to 80

The main donor site is not recognized

Neutral

 

RP-807     MYO7A     40        c.5516T>C     p.Leu1839Pro          UV3           deleterious (0)       probably_damaging (1)      Score for the main acceptor site

decreases from 80 to 77

RP-1614    MYO7A     40       c.5537C>A     p.Prp1846His          UV3         deleterious (0.01)  possibly_damaging (0.85)    Score for the main acceptor site

decreases from 80 to 77 and one acceptor site is not recognized

Neutral                      Neutral                     Neutral

 

Neutral                      Neutral                     Neutral

 

RP-808     CDH23      10        c.871G>A      p.Gly291Arg           UV3           deleterious (0)       probably_damaging (1)                       Neutral                 Neutral      Neutral A new ESE site is

created

 

RP-1426    CDH23      39      c.5068-2A>T   c.5068-2A>T           UV4                    —                                —                         The main acceptor site is not

Score for the main

The main acceptor

 

recognized

acceptor site decreases  site is not recognized from 95 to 66

 

RP-1781    CDH23      68        c.9569C>T     p.Ala3190Val          UV3           deleterious (0)       probably_damaging (1)                       Neutral                  Neutral      Neutral                       Neutral

 

RP-1927    USH2A      2         c.269A>G       p.Tyr90Cys            UV3           tolerated (0.17)    possibly_damaging (0.796)  Score for acceptor site decreases

from 82 to 80

 

RP-1835    USH2A     22     c.4758+3A>G    c.4758+3A>G         UV3                    —                                —                           The main donor site is not

recognized

Neutral                              Score for acceptor site decreases from

75 to 69

Neutral              The main donor site decreases from 98 to

73

A ESE site is not recognized

 

 

RP-1960    USH2A     25       c.5167G>C     p.Gly1723Arg          UV3           deleterious (0)    probably_damaging (0.994)      The main donor site is not

recognized

Score for the main donor site decreases from 86 to 75

The main donor site is not recognized

Neutral

 

RP-1455    USH2A     28       c.5666A>G    p.Asp1889Gly         UV3           deleterious (0)    probably_damaging (0.982)    The main donor and acceptor sites

decrease from 82 to 80 and from 53 to 48 respectively and a new acceptor site is created

Neutral                      Neutral              Two ESEs are not recognized

 

RP-1496    GPR98      19      c.3443G>A     p.Gly1148Asp         UV3           deleterious (0)    probably_damaging (0.999)                   Neutral                  Neutral      Neutral                      Neutral RP-1929      GPR98     58                         c.11974G>A    p.Asp3992Asn              UV3                  deleterious (0.01)    probably_damaging (0.999)        Neutral     Neutral                  Neutral                                                   A ESE is not

recognized

RP-1950    GPR98      70       c.14278C>T    p.Pro4760Ser          UV3           deleterious (0)    probably_damaging (0.998)                   Neutral                  Neutral      Neutral                       Neutral

 

RP-1923    DFNB31    9        c.2234G>A     p.Arg745His           UV3          deleterious(0.01)    probably_damaging (0.984)                Neutral                                    Neutral                      The main donor site

increases from 66 to 86

Neutral

 

SIFT: SIFT Puntuación de 0 a 1. La sustitución de aminoácidos se prevé que sea dañina si la puntuación es <0,05, y tolerada si es> 0,05.
PolyPhen establece tres clasificaciones: “Probablemente perjudicial” (se cree muy probable que afecte a la función o a la estructura de la proteína), “posiblemente dañina” (se cree que afecta la función de proteínas o estructura), “benigno” (muy probablemente carece de cualquier efecto fenotípico).

ESE: Exonic empalme potenciador.

 

 

El análisis de segregación de alelos detectados con los respectivos miembros de la familia se realizó en 13 casos, y se verificó la cosegregación de las mutaciones con la enfermedad en todos estos casos (Tabla 3).

Detección CNVs

Next Generation Sequencing con el sistema de iluminación MiSeq nos permitió realizar un análisis cualitativo y cuantitativo. Hemos podido detectar no sólo mutaciones puntuales, sino también CNV.

En nuestra cohorte de pacientes se realizó un análisis CNV a todos los pacientes a los que no se habían detectado dos mutaciones puntuales. Este análisis nos permitió identificar seis grandes reordenamientos: tres supresiones en USH2A que comprenden los exones 14, 20 y 44, y tres duplicaciones que comprenden el exón 29 en CDH23, exones 22_23 en PCDH15 y exones 79_83 en GPR98. El USH2A y los reordenamientos CDH23 se detectaron en un estado heterocigótico, mientras que se registraron las duplicaciones PCDH15 y GPR98 en un estado homocigoto.

Se confirmaron grandes reordenamientos en USH2A y PCDH15 posteriormente por MLPA, mientras que los pacientes que llevaban duplicaciones que afectan CDH23 y GPR98 se analizaron por a- CGH (datos no mostrados). En 5 pacientes, se confirmaron los reordenamientos detectados por comparación de los datos normalizados cubiertos. La técnica a-CGH para confirmar la presencia de la duplicación heterocigótica de CDH23 (exón 29) en el paciente RP-1781 no tuvo éxito debido a problemas técnicos. Desafortunadamente, no fue posible obtener una nueva muestra de ADN para este paciente para repetir el experimento.

Tres de los seis reordenamientos encontrados en este estudio habían sido descritos anteriormente. Las eliminaciones USH2A del exón 14 y del exón 44 fueron descritas por Glockle et al. [35] y la duplicación GPR98 se describió previamente por Besnard et al. [52]. La supresión del exón 14 en USH2A también se ha detectado por nuestro grupo, en un paciente español USH en un estado homocigótico (resultados no publicados).

En nuestra cohorte de pacientes previamente no cribados hemos podido detectar 51 alelos alterados, seis de los cuales correspondían a grandes reordenamientos, es decir, 11,76% de los alelos patogénicos detectados.

En un paciente no se identificó ninguna mutación puntual, y el análisis cuantitativo no pudo realizarse (RP-531). La relación entre esta muestra y de los datos normalizada se modificó en un alto número de regiones objetivo de la mayoría de genes. En este caso, la imagen obtenida con el bioanalizador en la validación y cuantificación del proceso de ADN seleccionado enriquecido era atípico (Figura 3).

Figura 3 Imágenes obtenidos en la validación y cuantificación del ADN seleccionado enriquecido con el sistema Bioanalyzer 2100. A) Imagen típica obtenida en la mayoría de los pacientes. B) Imagen atípica obtenido en el paciente RP-531, en el cual el análisis CNV no se pudo realizar.

En algunos casos, se puede observar que el análisis CNV muestra resultados dudosos en las regiones seleccionadas. El análisis de esas regiones seleccionadas reveló coberturas inferiores a 250x.

 

Exposición

Casos resueltos

El síndrome de Usher muestra a la vez heterogeneidad genética y alélica. El número de genes relacionados con la enfermedad y el gran tamaño de la mayoría de ellos contribuyen a la heterogeneidad genética. Además, las mutaciones que causan la enfermedad incluyen mutaciones puntuales y grandes reordenamientos, la mayoría de ellos, siendo ocultos. Recientemente, el análisis de la secuencia de alto rendimiento y la secuenciación de nueva generación, ha demostrado ser muy útil para realizar estudios genéticos en enfermedades heterogéneas.

En este estudio, hemos desarrollado un método específico basado en NGS para el diagnóstico molecular del síndrome de Usher. Evaluamos nuestro panel en un grupo de pacientes con variantes USH conocidas y lo aplicamos a una cohorte de pacientes USH previamente no cribados.

En nuestras series de estudio, hemos sido capaces de detectar mutaciones bialélicas en un gen USH en 22 de 32 pacientes USH (68,75%) e identificar 51 de los 64 alelos mutados previstos (un ratio de detección de 79,7%).

Regiones descubiertas

Se obtuvo un alcance altamente heterogéneo utilizando un sistema HaloPlex Target Enrichment personalizado (ver Figura 1). Sin embargo, sólo una región incluida en el diseño final mostró un alcance medio inferior a 40x en nuestras muestras. Se corresponde a una secuencia de 43 pb en el exón 2 grande de MYO15A. Ese fragmento muestra un alto porcentaje de CGs, 77%. Se ha comunicado que la mayoría de plataformas de secuenciación, incluyendo secuenciadores Illumina, muestran el alcance de GC sesgado dependiente de contenido y los protocolos deben modificarse para minimizar estos sucesos [61].

Casos sin resolver

Las mutaciones no se detectaron en cuatro pacientes de nuestra cohorte. En un caso USH1 no se pudieron obtener datos clínicos detallados, mientras que en el resto de casos se revisó la información clínica y el diagnóstico USH se confirmó. Cinco pacientes adicionales eran portadores de sólo una variante patógena (Tabla 3), la segunda mutación permanecen sin identificar.

En estos casos, en la que el segundo alelo mutado escapa a la detección, la región que contiene la mutación podría haber sido excluida de nuestro estudio. Es posible que el gen responsable de la enfermedad aún no se hubiera identificado, y por tanto no podía ser incluido en nuestro panel. Por otra parte, las regiones intrónicas profundas, regiones promotoras o regions sin interpretar 5′ y 3′ no se incluyeron sistemáticamente en el diseño del panel. La única región intrónica objetivo en nuestro panel fue diseñado para detectar la mutación USH2A c.7595-2144A> G identificada por Vaché et al. [58] en cinco pacientes franceses y cuatro pacientes españoles. Por otra parte, se detectó posteriormente en cinco familias adicionales [31]. Posteriormente, Steele-Stallard et al. [31] detectó este cambio intrónico en tres familias USH británicas y europeas.

Se detectaron en dos pacientes dos alelos mutados, cada uno en un gen diferente, (Tabla 3). El paciente RP-1426 era portador de una variante MYO7A sustitutiva (p.Ala2204Pro). Usando el panel NGS no hemos podido detectar una segunda mutación en MYO7A, sino se encontró una mutación en CDH23 en la posición del aceptor de empalme (c.5068-2A> T). En el paciente USH2 RP-1950, se detectó la mutación USH2A c.2299delG y una variante sustitutiva nueva (p.Pro4760Ser) en GPR98. Los algoritmos Bioinformatics predijeron un efecto patogénico para estas dos nuevas variantes (Tabla 4). En el primer caso, las dos mutaciones estaban presentes en el mismo padre, clínicamente no afectado (datos no presentados), que no respalda una herencia digénica de USH. Desafortunadamente, el análisis de segregación no se pudo realizar en el caso de paciente RP-1950. Tal vez una segunda mutación permanece sin detectar en uno de estos genes en el paciente RP-1426 y RP-1950. En otros dos pacientes (RP-1847 y RP-1923) con mutaciones bialélicas en USH2A, hemos sido capaces de detectar mutaciones adicionales en USH1G y DFNB31, respectivamente. Estos casos muestran la alta potencia decisiva de re-secuenciación masiva en paralelo, detectando mutaciones adicionales en los pacientes portadores de dos mutaciones responsables de la enfermedad en el mismo gen.

Los programas utilizados para analizar los datos generados a partir de NGS siguieron diferentes algoritmos. De hecho, tanto la alineación y la llamada de base son dos pasos cruciales en estos análisis. Es posible que algunas mutaciones pudieran escapar a la detección debido a los algoritmos utilizados. Su modificación mejorará la calidad de los datos generados, evitando falsos negativos y permitiendo la detección de mutaciones perdidas en su posterior análisis.

Cuatro pacientes portaban dos mutaciones en genes típicamente responsables de otro subtipo clínico. Dos pacientes USH2 portaban mutaciones sustitutivas en MYO7A (RP-807 y RP-1864), un caso USH2 en CDH23 (RP-1781) y un paciente USH3 portaba una mutación con desfase homocigótica en USH2A (RP-890) (Tabla 2). La situación de los pacientes USH diagnosticados con subtipo clínico dado, que portan mutaciones en un gen implicado en un subtipo diferente, no es nueva, y se informó con anterioridad [25]. Estos hallazgos apoyan aún más el uso de técnicas de NGS que permitan el estudio de todos los genes conocidos causantes del síndrome de Usher en pacientes con independencia de su subtipo clínico. Facilita la detección de mutaciones en genes asociados típicamente con otros tipos clínicos.

Análisis de variación del número de copias
Estudios realizados en diferentes poblaciones han demostrado que los grandes reordenamientos son una causa importante de la enfermedad en el síndrome de Usher. Le Guedard et al. [62] y Aller et al. [29] demostraron que los reordenamientos PCDH15 son una causa significativa de alteraciones USH. Se han reportado grandes supresiones que involucran USH2A [22,35], y se han detectado grandes reordenamientos en otros genes USH como son MYO7A, CDH23 o GPR98 [30,62]. Estos resultados indican que el análisis genético en pacientes USH debería incluir la detección de reordenamientos.

Hemos obtenido con el sistema de MiSeq una cobertura media en nuestro panel USH de 1334x por muestra y región objetivo, lo que permite el análisis CNV de los genes seleccionados. Entonces hemos podido detectar en nuestra serie de pacientes seis reordenamientos diferentes en CDH23, PCDH15, USH2A y GPR98, que representa el 11,8% de los alelos detectados mutados. Hemos observado que cuando la cobertura de regiones cayó por debajo de 250x, los resultados obtenidos en el análisis CNV eran cuestionables y que no tuvimos en cuenta esas regiones. Con el fin de realizar un análisis cuantitativo, se recomienda, por lo tanto, la cobertura de las regiones seleccionadas por encima de 250x.

En un paciente (RP-531) la validación del proceso de enriquecimiento dio una imagen atípica en el bioanalizador (Figura 3). En este caso no se pudo realizar el análisis CNV. Sin embargo, esto no afecta a la detección de mutaciones puntuales. De hecho, en otro paciente con una imagen similar en la validación (RP-808), se detectaron dos mutaciones puntuales.

Comparación con otros estudios NGS de USH

Tradicionalmente, se utilizó la secuenciación de Sanger para identificar las mutaciones responsables de la enfermedad [25,50]. Hoy en día se han utilizado diferentes métodos basados en NGS para el síndrome de Usher. Licastro et al. [36] empleó dos enfoques diferentes: la secuenciación del exoma completo y secuenciación long-PCR de nueve genes USH. La secuenciación del exoma entera tiene varios problemas: una baja cobertura de las regiones de interés y la necesidad de una correcta interpretación de la gran cantidad de variaciones de secuencias identificadas. En cuanto al método long-PCR, muestra una mejor cobertura media, superior a 25x en 94% de las regiones. Tomando en conjunto ambos enfoques, la detección de alelos patogénicos fue del 62,5%.

Recientemente, Besnard et al. [37] desarrolló un panel objetivo NGS donde se incluyeron 9 USH genes, 2 genes USH candidatos (VEZT y PDZD7), siete genes de pérdida de audición y CHM. La profundidad total de la cobertura obtenida se estimó en 77x para todo el diseño que van desde 55.8x a 106.9x, con una tasa de detección de 84,6% en la cohorte USH estudiada.

En nuestra serie, la tasa de detección de alelos mutados fue del 79,7%. Nuestros resultados están cerca del estudio de Besnard et al. [37] y son más altos que en la aproximación de Licastro et al. [36]. Sin embargo, es difícil obtener conclusiones debido al bajo número de pacientes incluidos en los estudios (trece y doce pacientes USH, respectivamente), mientras que en nuestra serie se secuenciaron 32 pacientes USH previamente no cribados.

Además, en ambos estudios previos, sólo se detectaron mutaciones puntuales. La cobertura media obtenida no permitió el análisis de CNVs, que se ha observado como una importante causa USH. Como ha señalado Eisenberger et al. [63], una cobertura alta y extensa permite el análisis sistemático de CNVs y reduce el riesgo de que escapen mutaciones a la detección debido a su localización en regiones con baja cobertura.

Conclusiones

Nuestro método NGS objetivo desarrollado en base a la tecnología de enriquecimiento gen objetivo HaloPlex para el diagnóstico genético de síndrome de Usher proporciona una cobertura casi completa de todas las regiones codificadas de los diez genes USH y cuatro genes relacionados y candidatos USH. Además, la alta cobertura obtenida en nuestro estudio nos permitió detectar grandes reordenamientos. Es importante detectar ambas mutaciones puntuales y grandes supresiones o duplicaciones con una sola técnica para minimizar el coste económico de estos estudios, incrementando de la ratio de detección de la causa genética de la enfermedad y mejorando el diagnóstico genético de los pacientes con síndrome de Usher.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

MJA realizó la captura de secuencias, análisis de variantes y la confirmación del punto de mutaciones por secuenciación Sanger; EA contribuyó a la captura de secuencia, al análisis de variante de número de copia, MLPA y a la preparación de manuscritos; CFG contribuido al análisis de variante y a la confirmación de mutaciones puntuales por secuenciación Sanger; GGG realizó un análisis a-CGH; AFR contribuyó al análisis a-CGH y a la preparación de manuscrito, RR realizó el análisis funcional in silico de mutaciones; RPVM contribuyó al diseño del panel de secuenciación dirigido de nueva generación y a la validación; FBK contribuyó al reclutamiento de pacientes y a la validación de muestras de ADN; CA contribuyó a reclutamiento de pacientes y a la preparación de manuscritos; TJ diseñó el panel de secuenciación dirigida de nueva generación, a la supervisión de los experimentos y redactó el manuscrito JMM supervisó el diseño y los experimentos y redactó el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.
Agradecimientos

 

Estamos muy agradecidos a FARPE y a todos los pacientes que participan en este estudio.

Este trabajo fue respaldado por la subvención PI13/00638 and PI13/00226 del Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS) Del Gobierno Español. Estamos muy agradecidos a la  ONCE, Retina CV y a FUNDALUCE. CIBERER (CB/06/07/1030) es una iniciativa del Instituto de Salud Carlos III del Gobierno de España. El bioanalizador ABI3500xl fue comprador con la subvención PROMIS (II12/00023) del Instituto de Salud Carlos III. MJA es beneficiario de una beca del Ministerio de Educación (REF: AP2009-3344). RR y RPVM son becarios de Miguel Servet (CP09/0118  and  CP11/00090,  respectivamente) del Instituto de Salud Carlos III, que está parcialmente financiada por el Fondo de Desarrollo Regional Europeo.

 

Referencias

 

  1. Espinos C, Millan JM, Beneyto M, Najera C: Epidemiology of Usher syndrome in Valencia and Spain. Community Genet 1998, 1:223–8.

 

  1. Keats BJ, Corey DP: The Usher syndrome Am J Med Genet 1999, 89:158–66. Review.

 

  1. Cohen M, Bitner-Glindzicz M, Luxon L: The changing face of Usher syndrome: clinical implication Int J Audiol 2007, 46:82–93.

 

  1. Millán JM, Aller E, Jaijo T, Blanco-Kelly F, Gimenez-Pardo A, Ayuso C: An update on the genetics of Usher syndrome. J Ophthalmol 2011, 2011:

 

  1. Chaïb H, Kaplan J, Gerber S, Vincent C, Ayadi H, Slim R, Munnich A, Weissenbach J, Petit C: A newly identified locus for Usher syndrome type I, USH1E, maps to chromosome 21q Hum Mol Genet 1997, 6:27–31.

 

  1. Ahmed ZM, Riazuddin S, Khan SN, Friedman PL, Riazuddin S, Friedman TB: USH1H, a novel locus for type I Usher syndrome, maps to chromosome 15q22-2 Clin Genet 2009, 75:86–91.

 

  1. Riazuddin S, Belyantseva IA, Giese AP, Lee K, Indzhykulian AA, Nandamuri SP, Yousaf R, Sinha GP, Lee S, Terrell D, Hegde RS, Ali RA, Anwar S, Andrade-Elizondo PB, Sirmaci A, Parise LV, Basit S, Wali A, Ayub M, Ansar M, Ahmad W, Khan SN, Akram J, Tekin M, Riazuddin S, Cook T, Buschbeck EK, Frolenkov GI, Leal SM, Friedman TB, et al: Alterations of the CIB2 calcium- and integrin-binding protein cause Usher syndrome type 1 J and nonsyndromic deafness DFN Nat Genet 2012, 44:1265–71.

 

  1. Ebermann I, Phillips JB, Liebau MC, Koenekoop RK, Schermer B, Lopez I, Schäfer E, Roux AF, Dafinger C, Bernd A, Zrenner E, Claustres M, Blanco B, Nürnberg G, Nürnberg P, Ruland R, Westerfield M, Benzing T, Bolz HJ: PDZD7 is a modifier of retinal disease and a contributor to digenic Usher syndrome. J Clin Invest 2010, 120:1812–2

 

  1. Puffenberger EG, Jinks RN, Sougnez C, Cibulskis K, Willert RA, Achilly NP, Cassidy RP, Fiorentini CJ, Heiken KF, Lawrence JJ, Mahoney MH, Miller CJ, Nair DT, Politi KA, Worcester KN, Setton RA, Dipiazza R, Sherman EA, Eastman JT, Francklyn C, Robey-Bond S, Rider NL, Gabriel S, Morton DH, Strauss KA: Genetic mapping and exome sequencing identify variants associated with five novel disease PLoS One 2012, 7:e28936.

 

  1. Khateb S, Zelinger L, Mizrahi-Meissonnier L, Ayuso C, Koenekoop RK, Laxer U, Gross M, Banin E, Sharon D: A homozygous nonsense CEP250 mutation combined with a heterozygous nonsense C2orf71 mutation is associated with atypical Usher syndrome. J Med Genet 2014, Epub ahead of pr

 

  1. Kremer H, van Wijk E, Märker T, Wolfrum U, Roepman R: Usher syndrome:molecular links of pathogenesis, proteins and pathw Hum Mol Genet 2006, 15:ᅟ. Spec No:R262-

70.

 

  1. Michalski N, Michel V, Bahloul A, Lefèvre G, Barral J, Yagi H, Chardenoux S, Weil D, Martin P, Hardelin JP, Sato M, Petit C: Molecular characterization of the ankle-link complex in cochlear hair cells and its role in the hair bundle functionin J Neurosci 2007, 13:6478–88.

 

  1. Grati M, Shin JB, Weston MD, Green J, Bhat MA, Gillespie PG, Kachar B: Localization of PDZD7 to the stereocilia ankle-link associates this scaffolding protein with the Usher syndrome protein network. J Neurosci 2012, 32:14288–14293.

 

  1. Bahloul A, Simmler MC, Michel V, Leibovici M, Perfettini I, Roux I, Weil D, Nouaille S, Zuo J, Zadro C, Licastro D, Gasparini P, Avan P, Hardelin JP, Petit C: Vezatin, an integral membrane protein of adherens junctions, is required for the sound resilience of cochlear hair ce EMBO Mol Med 2009, 1:125–38.

 

  1. Kazmierczak P, Sakaguchi H, Tokita J, Wilson-Kubalek EM, Milligan RA, Müller U, Kachar B: Cadherin 23 and protocadherin 15 interact to form tip-link filaments in sensory hair ce Nature 2007, 449:87–91.

 

  1. El-Amraoui A, Petit C: Cadherins as targets for genetic disease Cold Spring Harb Perspect Biol 2010, 2(1):a003095.

 

  1. Muller U: Cadherins and mechanotransduction by hair ce Curr Opin Cell Biol

2008, 20:557–566.

 

  1. Sakaguchi H, Tokita J, Muller U, Kachar B: Tip links in hair cells: molecular composition and role in hearing Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg 2009, 17:388–393.

 

  1. Wang A, Liang Y, Fridell RA, Probst FJ, Wilcox ER, Touchman JW, Morton CC, Morell RJ, Noben-Trauth K, Camper SA, Friedman TB: Association of unconventional myosin

 

MYO15 mutations with human nonsyndromic deafness DFNB3. Science 1998, 29:1447– 51.

 

  1. Belyantseva IA, Boger ET, Naz S, Frolenkov GI, Sellers JR, Ahmed ZM, Griffith AJ, Friedman TB: Myosin-XVa is required for tip localization of whirlin and differential elongation of hair-cell stereoc Nat Cell Biol 2005, 7:148–156.

 

  1. Delprat B, Michel V, Goodyear R, Yamasaki Y, Michalski N, El-Amraoui A, Perfettini I, Legrain P, Richardson G, Hardelin JP, Petit C: Myosin XVa and whirlin, two deafness gene products required for hair bundle growth, are located at the stereocilia tips and interact direct Hum Mol Genet 2005, 1:401–10.

 

  1. Maerker T, van Wijk E, Overlack N, Kersten FF, McGee J, Goldmann T, Sehn E, Roepman R, Walsh EJ, Kremer H, Wolfrum U: A novel Usher protein network at the periciliary reloading point between molecular transport machineries in vertebrate photoreceptor ce Hum Mol Genet 2008, 17:71–86.

 

  1. Sahly I, Dufour E, Schietroma C, Michel V, Bahloul A, Perfettini I, Pepermans E, Estivalet A, Carette D, Aghaie A, Ebermann I, Lelli A, Iribarne M, Hardelin JP, Weil D, Sahel JA, El-Amraoui A, Petit C: Localization of Usher 1 proteins to the photoreceptor calyceal processes, which are absent from mice. J Cell Biol 2012, 199:381–99.

 

  1. Cosgrove D, Zallocchi M: Usher protein functions in hair cells and photoreceptor

Int J Biochem Cell Biol 2014, 46:80–9.

 

  1. Bonnet C, Grati M, Marlin S, Levilliers J, Hardelin JP, Parodi M, Niasme-Grare M, Zelenika D, Délépine M, Feldmann D, Jonard L, El-Amraoui A, Weil D, Delobel B, Vincent C, Dollfus H, Eliot MM, David A, Calais C, Vigneron J, Montaut-Verient B, Bonneau D, Dubin J, Thauvin C, Duvillard A, Francannet C, Mom T, Lacombe D, Duriez F, Drouin- Garraud V, et al: Complete exon sequencing of all known Usher syndrome genes greatly improves molecular diagn Orphanet J Rare Dis 2011, 6:21.

 

  1. Cremers FP, Kimberling WJ, Külm M, de Brouwer AP, van Wijk E, te Brinke H, Cremers CW, Hoefsloot LH, Banfi S, Simonelli F, Fleischhauer JC, Berger W, Kelley PM, Haralambous E, Bitner-Glindzicz M, Webster AR, Saihan Z, De Baere E, Leroy BP, Silvestri G, McKay GJ, Koenekoop RK, Millan JM, Rosenberg T, Joensuu T, Sankila EM, Weil D, Weston MD, Wissinger B, Kremer H: Development of a genotyping microarray for Usher syndrome. J Med Genet 2007, 44:153–60.

 

  1. Jaijo T, Aller E, García-García G, Aparisi MJ, Bernal S, Avila-Fernández A, Barragán I, Baiget M, Ayuso C, Antiñolo G, Díaz-Llopis M, Külm M, Beneyto M, Nájera C, Millán JM: Microarray-based mutation analysis of 183 Spanish families with Usher syndrome. Invest Ophthalmol Vis Sci 2010, 51:1311–1317.

 

  1. Vozzi D, Aaspõllu A, Athanasakis E, Berto A, Fabretto A, Licastro D, Külm M, Testa F, Trevisi P, Vahter M, Ziviello C, Martini A, Simonelli F, Banfi S, Gasparini P: Molecular epidemiology of Usher syndrome in It Mol Vis 2011, 17:1662–8.

 

  1. Aller E, Jaijo T, García-García G, Aparisi MJ, Blesa D, Díaz-Llopis M, Ayuso C, Millán JM: Identification of large rearrangements of the PCDH15 gene by combined MLPA

 

and a CGH: large duplications are responsible for Usher syndrome. Invest Ophthalmol Vis Sci 2010, 51:5480–5485.

 

  1. Roux AF, Faugère V, Vaché C, Baux D, Besnard T, Léonard S, Blanchet C, Hamel C, Mondain M, Gilbert-Dussardier B, Edery P, Lacombe D, Bonneau D, Holder-Espinasse M, Ambrosetti U, Journel H, David A, Lina-Granade G, Malcolm S, Claustres M: Four-year follow up of diagnostic service in USH1 patient Invest Ophthalmol Vis Sci 2011, 52:4063–4071.

 

  1. Steele-Stallard HB, Le Quesne SP, Lenassi E, Luxon LM, Claustres M, Roux AF, Webster AR, Bitner-Glindzicz M: Screening for duplications, deletions and a common intronic mutation detects 35% of second mutations in patients with USH2A monoallelic mutations on Sanger sequencin Orphanet J Rare Dis 2013, 8:122.

 

  1. Choi BY, Park G, Gim J, Kim AR, Kim BJ, Kim HS, Park JH, Park T, Oh SH, Han KH, Park WY: Diagnostic application of targeted resequencing for familial nonsyndromic hearing PLoS One 2013, 22:e68692.

 

  1. Mutai H, Suzuki N, Shimizu A, Torii C, Namba K, Morimoto N, Kudoh J, Kaga K, Kosaki K, Matsunaga T: Diverse spectrum of rare deafness genes underlies early- childhood hearing loss in Japanese patients: a cross-sectional, multi-center next- generation sequencing stud Orphanet J Rare Dis 2013, 8:172.

 

  1. Fu Q, Wang F, Wang H, Xu F, Zaneveld JE, Ren H, Keser V, Lopez I, Tuan HF, Salvo JS, Wang X, Zhao L, Wang K, Li Y, Koenekoop RK, Chen R, Sui R: Next-generation sequencing-based molecular diagnosis of a Chinese patient cohort with autosomal recessive retinitis pigment Invest Ophthalmol Vis Sci 2013, 54:4158–66.

 

  1. Glöckle N, Kohl S, Mohr J, Scheurenbrand T, Sprecher A, Weisschuh N, Bernd A, Rudolph G, Schubach M, Poloschek C, Zrenner E, Biskup S, Berger W, Wissinger B, Neidhardt J: Panel-based next generation sequencing as a reliable and efficient technique to detect mutations in unselected patients with retinal dystrophie Eur J Hum Genet 2014, 22:99–104.

 

  1. Licastro D, Mutarelli M, Peluso I, Neveling K, Wieskamp N, Rispoli R, Vozzi D, Athanasakis E, D’Eustacchio A, Pizzo M, D’Amico F, Ziviello C, Simonelli F, Fabretto A, Scheffer H, Gasparini P, Banfi S, Nigro V: Molecular diagnosis of Usher syndrome: application of two different next generation sequencing-based procedure PLoS One 2012, 7:e43799.

 

  1. Besnard T, García-García G, Baux D, Vaché C, Faugère V, Larrieu L, Léonard S, Millan JM, Malcolm S, Claustres M, Roux AF: Experience of targeted Usher exome sequencing as a clinical test. Mol Genet Genomic Med 2014, 2:30–43.

 

  1. Yoshimura H, Iwasaki S, Nishio SY, Kumakawa K, Tono T, Kobayashi Y, Sato H, Nagai K, Ishikawa K, Ikezono T, Naito Y, Fukushima K, Oshikawa C, Kimitsuki T, Nakanishi H, Usami S: Massively parallel DNA sequencing facilitates diagnosis of patients with Usher syndrome type PLoS One 2014, 9:e90688.

 

  1. Rong W, Chen X, Zhao K, Liu Y, Liu X, Ha S, Liu W, Kang X, Sheng X, Zhao C: Novel and recurrent MYO7A mutations in Usher syndrome type 1 and type PLoS One 2014, 9(5):e97808. doi:10.1371/journal.pone.0097808. eCollection 2014.

 

  1. von Brederlow B, Bolz H, Janecke A, La O, Cabrera A, Rudolph G, Lorenz B, Schwinger E, Gal A: Identification and in vitro expression of novel CDH23 mutations of patients with Usher syndrome type 1D. Hum Mutat 2002, 19:268–73.

 

  1. Garcia-Garcia G, Aparisi MJ, Jaijo T, Rodrigo R, Leon AM, Avila-Fernandez A, Blanco- Kelly F, Bernal S, Navarro R, Diaz-Llopis M, Baiget M, Ayuso C, Millan JM, Aller E: Mutational screening of the USH2A gene in Spanish USH patients reveals 23 novel pathogenic mutation Orphanet J Rare Dis 2011, 6:65.

 

  1. Schultz JM, Bhatti R, Madeo AC, Turriff A, Muskett JA, Zalewski CK, King KA, Ahmed ZM, Riazuddin S, Ahmad N, Hussain Z, Qasim M, Kahn SN, Meltzer MR, Liu XZ, Munisamy M, Ghosh M, Rehm HL, Tsilou ET, Griffith AJ, Zein WM, Brewer CC, Riazuddin S, Friedman TB: Allelic hierarchy of CDH23 mutations causing non- syndromic deafness DFNB12 or Usher syndrome USH1D in compound heterozygote J Med Genet 2011, 48:767–75.

 

  1. Roux AF, Faugère V, Le Guédard S, Pallares-Ruiz N, Vielle A, Chambert S, Marlin S, Hamel C, Gilbert B, Malcolm S, Claustres M, French Usher Syndrome Collaboration: Survey of the frequency of USH1 gene mutations in a cohort of Usher patients shows the importance of cadherin 23 and protocadherin 15 genes and establishes a detection rate of above 90%. J Med Genet 2006, 43:763–8.

 

  1. Ahmed ZM, Riazuddin S, Bernstein SL, Ahmed Z, Khan S, Griffith AJ, Morell RJ, Friedman TB, Riazuddin S, Wilcox ER: Mutations of the protocadherin gene PCDH15 cause Usher syndrome type 1 F. Am J Hum Genet 2001, 69(1):25–34.

 

  1. Jaijo T, Oshima A, Aller E, Carney C, Usami S, Millán JM, Kimberling WJ: Mutation screening of the PCDH15 gene in Spanish patients with Usher syndrome type Mol Vis 2012, 18:1719–26.

 

  1. Riazuddin S, Nazli S, Ahmed ZM, Yang Y, Zulfiqar F, Shaikh RS, Zafar AU, Khan SN, Sabar F, Javid FT, Wilcox ER, Tsilou E, Boger ET, Sellers JR, Belyantseva IA, Riazuddin S, Friedman TB: Mutation spectrum of MYO7A and evaluation of a novel nonsyndromic deafness DFNB2 allele with residual function. Hum Mutat 2008, 29:502–11.

 

  1. Liu XZ, Hope C, Liang CY, Zou JM, Xu LR, Cole T, Mueller RF, Bundey S, Nance W, Steel KP, Brown SD: A mutation (2314delG) in the Usher syndrome type IIA gene: high prevalence and phenotypic variation. Am J Hum Genet 1999, 64(4):1221–5.

 

  1. Bharadwaj AK, Kasztejna JP, Huq S, Berson EL, Dryja TP: Evaluation of the myosin VIIA gene and visual function in patients with Usher syndrome type Exp Eye Res 2000, 71:173–81.

 

  1. Aller E, Jaijo T, Beneyto M, Nájera C, Oltra S, Ayuso C, Baiget M, Carballo M, Antiñolo G, Valverde D, Moreno F, Vilela C, Collado D, Pérez-Garrigues H, Navea A, Millán JM:

 

Identification of 14 novel mutations in the long isoform of USH2A in Spanish patients with Usher syndrome type II. J Med Genet 2006, 43:e55.

 

  1. Le Quesne SP, Saihan Z, Rangesh N, Steele-Stallard HB, Ambrose J, Coffey A, Emmerson J, Haralambous E, Hughes Y, Steel KP, Luxon LM, Webster AR, Bitner- Glindzicz M: Comprehensive sequence analysis of nine Usher syndrome genes in the UK National Collaborative Usher Stud J Med Genet 2012, 49(1):27–36.

 

  1. Ouyang XM, Yan D, Du LL, Hejtmancik JF, Jacobson SG, Nance WE, Li AR, Angeli S, Kaiser M, Newton V, Brown SD, Balkany T, Liu XZ: Characterization of Usher syndrome type I gene mutations in an Usher syndrome patient population. Hum Genet 2005, 116(4):292–9.

 

  1. Besnard T, Vaché C, Baux D, Larrieu L, Abadie C, Blanchet C, Odent S, Blanchet P, Calvas P, Hamel C, Dollfus H, Lina-Granade G, Lespinasse J, David A, Isidor B, Morin G, Malcolm S, Tuffery-Giraud S, Claustres M, Roux AF: Non-USH2A mutations in USH2 patient Hum Mutat 2012, 33:504–510.

 

  1. Oshima A, Jaijo T, Aller E, Millan JM, Carney C, Usami S, Moller C, Kimberling WJ: Mutation profile of the CDH23 gene in 56 probands with Usher syndrome type Hum Mutat 2008, 29(6):E37–46.

 

  1. Janecke AR, Meins M, Sadeghi M, Grundmann K, Apfelstedt-Sylla E, Zrenner E, Rosenberg T, Gal A: Twelve novel myosin VIIA mutations in 34 patients with Usher syndrome type I: confirmation of genetic heterogeneit Hum Mutat 1999, 13:133–40.

 

  1. Bernal S, Medà C, Solans T, Ayuso C, Garcia-Sandoval B, Valverde D, Del Rio E, Baiget M: Clinical and genetic studies in Spanish patients with Usher syndrome type II: description of new mutations and evidence for a lack of genotype—phenotype correlation. Clin Genet 2005, 68:204–14.

 

  1. Jacobson SG, Aleman TS, Sumaroka A, Cideciyan AV, Roman AJ, Windsor EA, Schwartz SB, Rehm HL, Kimberling WJ: Disease boundaries in the retina of patients with Usher syndrome caused by MYO7A gene mutation Invest Ophthalmol Vis Sci 2009, 50:1886–94.

 

  1. Kaiserman N, Obolensky A, Banin E, Sharon D: Novel USH2A mutations in Israeli patients with retinitis pigmentosa and Usher syndrome type Arch Ophthalmol 2007, 125:219–24.

 

  1. Vaché C, Besnard T, le Berre P, García-García G, Baux D, Larrieu L, Abadie C, Blanchet C, Bolz HJ, Millan J, Hamel C, Malcolm S, Claustres M, Roux AF: Usher syndrome type 2 caused by activation of an USH2A pseudoexon: implications for diagnosis and therap Hum Mutat 2012, 33:104–8.

 

  1. Ouyang XM, Xia XJ, Verpy E, Du LL, Pandya A, Petit C, Balkany T, Nance WE, Liu XZ: Mutations in the alternatively spliced exons of USH1C cause non syndromic recessive deafne Hum Genet 2002, 111(1):26–30.

 

  1. Jaijo T, Aller E, Beneyto M, Najera C, Graziano C, Turchetti D, Seri M, Ayuso C, Baiget M, Moreno F, Morera C, Perez-Garrigues H, Millan JM: MYO7A mutation screening in Usher syndrome type I patients from diverse origin J Med Genet 2007, 44(3):e71.

 

  1. Ross M, Russ C, Costello M, Hollinger A, Lennon NJ, Hegarty R, Nusbaum C, Jaffe DB:

Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biol 2013, 14:R51.

 

  1. Le Guédard S, Faugère V, Malcolm S, Claustres M, Roux AF: Large genomicrearrangements within the PCDH15 gene are a significant cause of USH1F syndrome. Mol Vis 2007, 13:102–7.

 

  1. Eisenberger T, Neuhaus C, Khan AO, Decker C, Preising MN, Friedburg C, Bieg A, Gliem M, Charbel Issa P, Holz FG, Baig SM, Hellenbroich Y, Galvez A, Platzer K, Wollnik B, Laddach N, Ghaffari SR, Rafati M, Botzenhart E, Tinschert S, Börger D, Bohring A, Schreml J, Körtge-Jung S, Schell-Apacik C, Bakur K, Al-Aama JY, Neuhann T, Herkenrath P, Nürnberg G, et al: Increasing the yield in targeted next-generation sequencing by implicating CNV analysis, non-coding exons and the overall variant load: the example of retinal dystrophie PLoS One 2013, 8:e78496.

 

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Amarantus Anuncia Positivos Datos preclínicos sobre los Efectos de MANF sobre la Visión en un modelo de Retinosis Pigmentaria  

SAN FRANCISCO y GINEBRA, 25 de noviembre 2014 (GLOBE NEWSWIRE) – Amarantus BioScience Holdings, Inc. (OTCQB: AMBS), una compañía biotecnológica centrada en el desarrollo de diagnósticos y productos terapéuticos en las áreas de neurología, psiquiatría, oftalmología y medicina regenerativa, ha anunciado efectos positivos del factor neurotrófico derivado del mesencefálico-astrocitos (MANF) para la protección de pérdida de visión en un modelo animal de la retinitis pigmentosa (RP). MANF fue descubierto utilizando la proteína Amarantus propiedad de PhenoGuard ™

El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de la protección de la agudeza visual mediante una única inyección intravítrea de MANF en el modelo genético de ratón Rd10 de RP. Estos animales llevan una mutación espontánea en un punto de cambio sin sentido en PDE6B (GMPc fosfodiesterasa 6B, receptor de varilla, polipéptido beta). Las mutaciones en este gen se encuentran en la retinosis pigmentaria autosómica recesiva humana.

La agudeza visual se determina midiendo el umbral de frecuencia espacial mediante el seguimiento de optocinético. Este método permite una evaluación no invasiva de la agudeza visual en roedores y especies superiores, incluidos los humanos.

Una sola administración intravítrea de MANF después de la aparición de degeneración de la retina en el día 31 resultó en un efecto protector estadísticamente significativo sobre la agudeza visual en el Día 38 y el Día 45, en comparación con los animales tratados con placebo.

Esta es la primera observación de MANF en proporcionar un beneficio funcional sobre la visión en un modelo de RP. Estos datos complementan los efectos ya conocidos de MANF en la preservación de la morfología de la retina en los modelos de RP. Los experimentos se llevaron a cabo en un laboratorio contratado de investigación líder en oftalmología.

“Nuestros resultados son la primera observación de la protección de la visión en un modelo de RP por MANF, y añaden una lectura funcional de la agudeza visual seminal a los hallazgos de protección morfológicas iniciales reportados por la Universidad de Bascom Palmer Eye Institute de Miami”, dijo el Dr. David A. Lowe, Presidente y CEO de NeuroAssets y miembro de la Junta de Administración de Amarantus. “Estos datos apoyan aún más nuestro enfoque en indicaciones huérfanas oftálmicas, como lo demuestra la reciente solicitud a la FDA para la designación de medicamento huérfano en RP.”

En octubre de 2014, la Compañía aplicó a la Food & Drug Administration para designación de fármaco huérfano para MANF en RP. La Compañía espera recibir una respuesta en un futuro próximo.

“Estos datos prometedores proporcionan una base convincente para continuar el desarrollo de MANF en RP hacia los primeros estudios en humanos”, dijo Gerald E. Commissiong, Presidente y CEO de Amarantus.

“Vamos a seguir adelante con un plan de desarrollo estratégico centrado inicialmente en las enfermedades oculares huérfanas, donde vemos un enorme potencial para MANF. Tenemos la esperanza de desarrollar mejores tratamientos para los pacientes que sufren de enfermedades que conducen a la ceguera debido a una variedad de condiciones médicas.

En última instancia, creemos que la prueba de concepto para MANF en estudios humanos en enfermedades oculares apoyará el desarrollo MANF en otras áreas terapéuticas en las que los datos de eficacia preclínica sean convincentemente significativos, hayan sido publicados y confirmados por grupos independientes, así como los propios datos de la empresa. Creemos firmemente que MANF tiene un potencial enorme en oftalmología, neurología, cardiología y enfermedades metabólicas, como la diabetes “.

El Departamento de Defensa en la Lucha Contra la Ceguera en Estados Unidos

25 de noviembre 2014 – Imagine que es ciego y está recogiendo un pimiento y al instante reconocer que es de color rojo o verde, o tocar una camisa en su armario y hacer que se describe junto con recomendaciones para lo que debe llevar con él. Así es como Jon E. Froehlich , Ph.D., de la Universidad de Maryland, College Park, describe las capacidades de un nuevo sistema que está en desarrollo. Su tecnología, diseñada para permitir a los ciegos “ver” con sus manos, utiliza cámaras montadas en los dedos y dispositivos de vibración de retroalimentación.

Dr. Froehlich es uno de los ocho galardonados recientemente con el Departamento de Defensa de EE.UU. (DOD) subvenciones por un total $ 5,700,000 que tienen el potencial de beneficiar a las personas con enfermedades hereditarias de retina. Muchos son de largo alcance esfuerzos utilizando tecnologías muy avanzadas y técnicas de investigación, y todos están entre los 22 premios por un total de aproximadamente $ 15 millones entregados a través de la visión del Programa de Investigación de Trauma del departamento (VTRP).

El programa es necesario por una variedad de razones. Hay 165.000 veteranos ciegos o con discapacidad visual en los Estados Unidos, según la Asociación de Ciegos de Veteranos . Alrededor del 13 por ciento de los militares heridos en Irak y Afganistán experimentó una lesión ocular grave. Y, como con la población civil, los veteranos algunas veces son diagnosticados con enfermedades de la retina, como la retinitis pigmentosa , enfermedad de Stargardt y la degeneración macular relacionada con la edad . Debido a que la Fundación Lucha contra la Ceguera (FFB) apoya la investigación para salvar la visión, tenía una mano en la toma de la VTRP posible.

“Me quito el sombrero a James Jorkasky, director ejecutivo de la Alianza Nacional para los ojos y Vision Research (NAEVR), que, en colaboración con FFB, trabajó incansablemente en el Capitolio para abogar por fondos VTRP “, dice William T. Schmidt, el director ejecutivo de la Fundación y secretario NAEVR. “James y su equipo hicieron un montón de trabajo pesado para que esta financiación sea posible.”

A continuación se presentan los resúmenes de los otros siete premios VTRP pertinentes al enfoque de FFB en enfermedades de la retina.

Trasplantes Ojo completo

Un trasplante conjunto de ojos, o WET, es la práctica de la sustitución de un ojo que está enfermo o herido con un ojo sano de un donante. Tan ambicioso como el enfoque parece, dos investigadores de la Universidad de Pittsburgh – Kia M. Washington , MD, y Vijay S. Gorantla , MD, Ph.D. – Están trabajando hacia ese objetivo individualmente. Cada investigador, apoyado por una beca VTRP, es la esperanza de realizar WET en un modelo de mamífero, de manera que, con el tiempo, el trabajo se puede hacer en los seres humanos. El gran reto es conectar la retina al nervio óptico, que se compone de un millón de fibras. WET se ha realizado en los reptiles, pero hacerlo con éxito en mamíferos sería un gran paso adelante.

Imprimir  tejido de la retina

La idea del  bioprinting tridimensional para generar nuevos órganos y tejidos puede sonar a ciencia ficción, pero Shaochen  Chen , Ph.D., de la Universidad de California, San Diego, es el desarrollo de una técnica para “imprimir”, o construir, nuevos tejidos de la retina que podrían trasplantarse en pacientes. El papel es normalmente la entrada en un proceso de impresión, pero en bioprinting, las entradas incluyen células, proteínas, y otros biomateriales para la construcción de la estructura de la retina tridimensional que se pueden trasplantar en seres humanos.

Regeneración celular de la retina.

gracias a estudios en humanos,  con un crecimiento potencial para restaurar la visión mediante la sustitución de los fotorreceptores perdidos utilizando células madre. Incluso hay investigaciones en marcha del laboratorio para regenerar sus propios fotorreceptores. José A. Brzezinski , Ph.D., de la Universidad de Colorado en Denver, ha recibido una subvención VTRP para desarrollar conos a partir de células madre embrionarias humanas. Los conos son los fotorreceptores que proporcionan la visión central y la capacidad de leer y reconocer los rostros de sus seres queridos. Por el contrario, Douglas C. Dean , Ph.D., de la Universidad de Louisville, está explorando la posibilidad de estimular las células gliales de Müller de la retina para que crezcan nuevos fotorreceptores para restaurar la visión.

Neuroprotección

Un colirio para disminuir o prevenir la pérdida de visión puede parecer de la “vieja escuela” en comparación con los otros métodos que se están financiadas por el Departamento de Defensa, pero es el método más cercano a pasar a ensayos clínicos o estudios en humanos. Jeff Mumm , Ph. D., de la Universidad Johns Hopkins, está estudiando compuestos potenciales de ahorro de la visión en el pez cebra, y de hecho utiliza fondos del FFB para apalancar el apoyo VTRP. Andrew Pieper , MD, Ph.D., en el Centro Médico VA en Iowa City, Iowa, está desarrollando un compuesto para prevenir la disfunción cognitiva y visual en las personas con lesión cerebral traumática.

R-Tech Ueno recibe designación de fármaco huérfano para Unoprostona isopropílico (Código de Desarrollo: UF-021) para el tratamiento de la Retinosis Pigmentaria.

TOKIO – R-Tech Ueno (JASDAQ: 4573)

R-Tech Ueno, Ltd. ha anunciado hoy que ha recibido oficialmente la designación de fármaco huérfano por parte del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar (MHLW) para la Unoprostona isopropílico (Unoprostona) (código de desarrollo: UF-021) para el tratamiento de la retinosis pigmentaria.

Medicamentos y productos biológicos con la designación de fármaco huérfano en Japón se definen como las destinadas a tratamientos seguros y efectivos, al diagnóstico y la prevención de las enfermedades raras / trastornos que afectan a menos de 50.000 pacientes (incidencia máxima de cuatro por diez mil), con incentivos para que los patrocinadores desarrollen productos huérfanos como revisión prioritaria de Aplicaciones de Nuevos Fármacos (NDA) por los farmacéuticos y Agencia de Dispositivos Médicos (PMDA), y conceder financiación para los patrocinadores.

Estamos desarrollando un agente terapéutico para el tratamiento de la retinosis pigmentaria con unoprostona como ingrediente principal y llevando a cabo un ensayo de fase 3 clínica de la solución oftálmica con unoprostona (código de desarrollo: UF-021) como el ingrediente principal (comunicado de prensa de 13 de marzo, 2013 ). Un ensayo clínico de fase 2 indica que el número de pacientes cuya sensibilidad en la retina central estaba deteriorada se redujo ( notas de prensa del 03 de junio y 15 de julio 2010 ). El desarrollo del tratamiento de la retinitis pigmentosa por unoprostona en Japón tiene el apoyo del gobierno y fue adoptado en el Adaptable y sin Trabas Tecnología Programa a través de (A-PASO) como I + D-Driven Target “a gran escala de I + D Etapa – Práctica Tipo Aplicación (Desarrollo Contrato)” por la Agencia Japonesa de Ciencia y Tecnología (JST) ( comunicado de prensa del 01 de febrero 2013 ). Estamos aumentando nuestros esfuerzos para la pronta aprobación de este fármaco.

Estamos autorizados del exterior para el desarrollo y los derechos de comercialización para unoprostona de Sucampo Pharmaceuticals, Inc. (Sucampo), para los Estados Unidos y Canadá en 2009, y luego a Estados Unidos, Canadá y el resto del mundo sin incluir nuestros propios territorios (Japón, Corea del Sur, Taiwán y China) en 2011. Si bien conservamos los derechos exclusivos para fabricar y suministrar productos unoprostona en nuestro territorio, que tienen una asociación eficaz con Sucampo para el desarrollo de ultramar de unoprostona.

Unoprostona ha sido designado como medicamento huérfano para el tratamiento de la retinosis pigmentaria, no sólo por la FDA en los Estados Unidos, sino también por la EMA en la Unión Europea, y socio de desarrollo del R-Tech Ueno, Sucampo decidirá en su camino hacia el futuro asumiendo nuestra Fase 3 de prueba si tiene éxito.

El emprendimiento anterior no contribuirá a toda revisión de las estimaciones de ganancias para todo el año pre-anunciados el 14 de mayo de 2014.

Para más detalles de la nota de prensa, por favor visite: http://www.rtechueno.com/en/investor/press/documents/141125_pr_en.pdf

Read more here: http://www.heraldonline.com/2014/11/24/6562180_r-tech-ueno-received-orphan-drug.html?sp=/100/773/385/&rh=1#storylink=cpy

Tecnología propia de los videojuegos para un visor destinado a personas con discapacidad visual

Nota: Esta información ha sido obtenida de la página web de Begisare.

Unos investigadores de la Unión Europea han desarrollado un visor 3D que puede contribuir a que las personas con discapacidad visual se desenvuelvan de manera más segura y sencilla.

© Thinkstock

El proyecto DIGIGLASSES arrancó en el año 2012 con el propósito de desarrollar una herramienta digital susceptible de ser comercializada y destinada a personas con discapacidad visual que utiliza la visión estereoscópica, modificada y personalizada para adaptarse a los síntomas específicos de la enfermedad ocular que padece cada usuario. En el último vídeo de YouTube del proyecto se anuncia la creación de líneas de productos para las pymes participantes.

El consorcio espera que la herramienta se encuentre disponible en el mercado para finales de 2015.Con alrededor de 5 millones de personas que en Europa (y de 285 millones en todo el mundo) se ven afectadas por algún grado de discapacidad visual que va más allá de lo que se puede solucionar con unas gafas convencionales, el mercado para el innovador visor de DIGIGLASSES resulta evidente. Junto a las oportunidades comerciales, el objetivo primordial del proyecto consiste en facilitar el acceso de quienes sufren estas deficiencias al mercado laboral y a la educación, así como la realización de actividades sociales, propiciando así que estos ciudadanos disfruten de una calidad de vida equiparable a la del resto de la sociedad. Para alcanzar esta meta, el proyecto se está sirviendo de tecnología similar a la que se emplea en la industria de los videojuegos.

Recientemente se han hecho pruebas del visor con la ayuda tanto de voluntarios afectados por discapacidades visuales como de formadores especializados que trabajan con estas personas para ayudarles a sacar el máximo partido a los nuevos dispositivos y herramientas. Dado el éxito de dichas pruebas, las pymes que participan en la iniciativa están ahora deseosas de desarrollar un dispositivo comercial a partir del prototipo con el propósito de que esté listo para salir al mercado a finales del próximo año.

El visor se compone de un par de gafas digitales, de componentes electrónicos y software creados a medida, de cámaras y de un procesador similar al de los teléfonos inteligentes. El usuario observa imágenes estereoscópicas optimizadas por el software.

La naturaleza de dicha optimización depende de las necesidades concretas del usuario. Por ejemplo, resulta posible incrementar el contraste, resaltar los bordillos de escaleras o aceras para que se distingan con mayor claridad, o bien delimitar los bordes de un paso de peatones con líneas rojas, entre otras posibilidades.

El elemento óptico incluye una micropantalla dotada con un alto nivel de brillo y resolución que actúa como un pequeño televisor. La tecnología óptica de aumento integrada (lentes y prismas) hace que la imagen de la pequeña pantalla se perciba como si procediera de una de grandes dimensiones.

Este tipo de dispositivos de visualización ya se ha usado con anterioridad en las industrias audiovisual y de los videojuegos; la innovación por parte del proyecto DIGIGLASSES consiste en aplicar esta tecnología para propiciar una mejora potencial del nivel de vida de un grupo de ciudadanos.

El consorcio se compone de ocho entidades de cinco países pertenecientes a los ámbitos de la investigación, la fabricación y la comercialización.

Para más información, consulte:

DIGIGLASSES
http://www.digiglasses.eu/home

“El Ojo Biónico” ARGUS podría tener más posibilidades, pudiendo tratar casi todas las formas de ceguera.

Presidente Greenberg de Second Sight: “El Ojo Biónico” podría tratar casi todas las formas de ceguera.

Noviembre 20, 2014

Second Sight Medical (SSM) la cual observó ayer su primera oferta publica en la bolsa de valores que subía un 122% podría tener su ojo biónico disponible para la mayoría de pacientes con ceguera en tan solo “un par de años” según el CEO Dr. Robert Greenberg dice a MassDevice.com

El Argus II, es un dispositivo que utiliza una cámara y estimulante eléctrico implantado en el ojo para convertir y de manera inalámbrica transmitir video e imágenes a una colección de electrodos en la superficie de la retina. El Argus II obtuvo la aprobación de la FDA el 13 de Febrero 2013 para uso en pacientes con retinosis pigmentaria avanzada.

Greenberg mencionó a MassDevice.com que el dispositivo de siguiente generación de SSM podría comunicarse desde la retina con una colección de electrodos implantados directamente en la porción del cerebro que maneja señales de la retina. Lo cual de manera efectiva eliminaría el nervio óptico por completo, expandiendo las posibilidades para tratar diversas formas de ceguera incluyendo glaucoma, retinopatía diabética y trauma afirma Greenberg.

“Los únicos exentos a este tratamiento serian aquellos con daños en el tejido cerebral causante por un derrame cerebral” comenta “Creemos que dentro de un par de años podríamos estar usando este dispositivo en pacientes”

SSM inició su debut en la bolsa de valores a $9 por acción, pero en breve subieron un 149.4% a un valor de $22.45 por acción. Estos valores resumieron el día de su debut a un asombroso $23.34 por valor un 159.3% por encima de su costo original.

Observando la importancia que le han otorgado los inversionistas a este valor preguntaron a Greenberg si hubiese deseado haber iniciado el precio de estos valores a un coste mayor. “Cuando hay mucha gente interesada en tu trabajo y desean ser parte de él eso siempre es positivo, no me arrepiento de nada” respondió.” Consideramos varias opciones para financiar y concluimos que la aprobación de la FDA para el Argus II nos daría la oportunidad de elevar el perfil de la compañía y ayudaría a dar a conocer este nuevo producto, y aún sigo sorprendido que a pesar de ello hay muchos pacientes que no nos conocen”.

Greenberg menciona que su meta primordial siempre ha sido tratar todas formas de ceguera. “Siempre he creído que esto estaba a nuestro alcance y ahora más que nunca ya que nuestro conocimiento del mapa cerebral humano es mayor que nunca”. La Idea es que con el mismo implante poder equiparlo con una mayor colección de electrodos en la superficie del cerebro y poder tratar a pacientes con el nervio óptico dañado.

Normaan era invidente, ahora es un niño normal, se ha curado de un tipo de retinosis pigmentaria.

Del Blog “Tratar de ver la Luz”, donde cuentan que Normaan tendrá ya la visita final después de realizarse el ensayo clínico para la amaurosis congénita de Leber, y completar todo el proceso de control y revisiones con el equipo de Jean Bennett y Albert Maguire en Philadelphia.

http://nomisjourney.blogspot.com.es/

Viernes, 05 de septiembre 2014

Ha pasado casi un año desde que Nomaan fue tratado. No he publicado tan a menudo como me hubiera gustado en los últimos meses. La vida, como es siempre el caso, me ha mantenido bastante ocupado. Entre el trabajo, la familia, la escuela, etc., todos hemos tenido las manos llenas.

Este año, hemos tenido sólo dos visitas a realizar. Recibí un correo electrónico esta semana, finalizando nuestros planes para nuestra próxima visita. En noviembre, vamos a tener nuestra visita final de 2014.

Después de ese tiempo, tendremos sólo visitas anuales. Esto me recordó a todos ustedes, nuestros lectores, y que os debemos una actualización, y también queremos llevar esta historia a su fin. Este blog ha llegado a tanta gente, y se ha leído casi 10.000 veces mientras escribo esto. Nunca me imaginé que tan bien sería recibido.

Recientemente conocí a un total desconocido en una reunión que dijo que ella no lee nuestro blog, pero también fue tocado por él.

Con eso se dice, este será mi último post.

Tanto ha cambiado para nuestra familia, para mejor por supuesto, como resultado de esta aventura.Alguien me dijo una vez, que en cada reto en la vida, Dios esconde bendiciones para aquellos que pueden mantener una actitud positiva y fiel a lo largo de sus luchas.

Cuando Nomi fue diagnosticada por primera vez, estábamos tan devastados, que no podíamos ver las bendiciones ocultas que pronto iban a ser depositado en nosotros. Los mayores beneficios han llegado a Nomi. Él se ha transformado en un joven que es mucho más seguro y autosuficiente. Él está siendo mejor en la escuela, y puede manejar tareas que solía necesitar ayuda, todo por su cuenta.

Se ha vuelto más sociable, y ha hecho nuevos amigos. Como familia, los frecuentes viajes a Filadelfia nos han dado la oportunidad de volver a conectar con viejos amigos, pasar tiempo con la familia que no tuvimos la oportunidad de ver mucho, y hacer nuevos amigos.

Hemos encontrado nuevas fuentes de inspiración y modelos de conducta para nuestro hijo, las personas que nos han mostrado que no hay nada más allá de su alcance, y no existe ninguna limitación que no puede superar.

Hemos podido experimentar una nueva ciudad, y ver otra parte del país, sumergirnos en la cultura y el paisaje local. Por supuesto, las millas de viajero frecuente son también muy bueno. :)

Nos sentimos verdaderamente honrados y bendecidos. Lo que más echaremos de menos, es el equipo de CHOP, la gente maravillosa que hicieron posible todo esto para él. Dr. Maguire, el Dr. Bennet, el Dr. Dan, Kathy, Sarah, y Dominique.

Como padres de Nomaan, esto nos motivó a no dar la espalda.Tratamos de mostrar nuestro apoyo a los demás, mediante el apoyo a otros esfuerzos de recaudación de fondos, o simplemente compartir nuestra historia.

Trabajos de investigación. Todo lo que necesitan es apoyo. A todos nuestros lectores por ahí, te imploro que dones.
Estamos dedicados personalmente hacia la investigación que se hace en la terapia génica y LCA (se pueden encontrar enlaces aquí en nuestro blog). Independientemente de esto, lo que cada vez la caridad que elija, es importante que usted dona tiempo, dinero, o conocimiento. No tiene que ser mucho. A poco se puede recorrer un largo camino.

Usted no puede darse cuenta de que son hoy en día, pero las donaciones que realice tendrá impacto en las vidas de personas en todo el mundo como Nomi.

Por medio de los esfuerzos de los que pueden dar y las personas que trabajan duro para hacer que los sueños se conviertan en realidad que los niños como nuestro hijo tienen nuevas oportunidades que se les presentan.

Aunque la historia de Nomi se ha dicho, su viaje no ha terminado. Él seguirá teniendo desafíos en su vida debido a su visión. Estos desafíos son ahora las cosas que sabe que puede vencer, y convertirse en el hombre que quiere ser.

No podemos seguir actualizando este blog, pero siempre estarán a disposición de cualquier persona que quiera información. Siéntase libre para llegar a través de correo electrónico o Facebook. Gracias por compartir nuestra alegría y siguiendo nuestro progreso hijos.

Siempre estaremos agradecidos a todos por su amor, apoyo y oraciones.

Adiós, buena suerte, y Dios los bendiga a todos. Con amor y gratitud, Basilio, Beenish, Raafay, Y Nomaan Maqbool.

Una nueva aplicación para Lectores de libros con Baja Visión.

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Una nueva aplicación para Lectores de libros con Baja Visión

 

Por Ben Shaberman el 18 de noviembre 2014

Spotlight texto

La discapacidad visual es un reto para las personas que aman los libros. Las Tecnologías acomodativas suelen ser caras y engorrosas, y muchas de las aplicaciones y los sistemas no se pueden configurar para satisfacer las necesidades específicas de lectura de cada persona.

Pero una nueva aplicación para Ipad llamada Spotlight Text  puede ser la solución para los amantes de los libros con discapacidad visual, jóvenes y mayores por igual. Se utiliza en conjunción con Bookshare , una biblioteca en línea sin fines de lucro para personas con dificultades para leer. El servicio de suscripción tiene acceso a 300.000 títulos, incluyendo el New York Times best-sellers y muchos libros de texto de K-12.

Una ventaja importante de Spotlight text es que permite al usuario elegir un modo de lectura que se adapte a su visión. Por ejemplo, el modo de carpa, que se desplaza texto horizontalmente, puede funcionar bien para las personas afectadas por retinosis pigmentaria (RP), que causa la pérdida de la visión periférica, así como la enfermedad de Stargardt y la degeneración macular relacionada con la edad , que conducen a la pérdida de la visión central. El Modo de tablero televisivo, que desplaza verticalmente el texto, también puede ser una buena opción para las personas que han perdido la visión central. Hay una opción de audio para las personas que están completamente ciegas.

El Dr. Howard Kaplan , un cirujano de la retina en el Valle de Hudson de Nueva York, quien desarrolló la aplicación, dice que hay dos grandes diferencias entre Spotlight text y otras tecnologías. Una de ellas es que el texto se puede hacer mucho más grande. De los otros, explica, “Para las personas con RP o degeneración macular, uno de los retos más difíciles con dispositivos de lectura acomodaticias es que sus ojos tienen que moverse. Si puedes mantener tus ojos relativamente estable, eso es mucho más fácil. Los pacientes realmente les gusta Spotlight text por esa razón “.

Spotlight text ha recibido elogios de los especialistas de baja visión en todo el país. La Academia Americana de Oftalmología (AAO) ordenó que su Comité de Rehabilitación de Baja Visión evaluara la aplicación antes de ponerlo en EyeSmart , sitio web de pacientes de la AAO.

Lindsey Teel, que trabaja en el Congreso y ha perdido gran parte de su visión por la enfermedad de Stargardt, utiliza Spotlight text para leer libros que ha querido leer durante mucho tiempo. “Actualmente lo estoy utilizando, dice ella. “Me gusta tanto el modo en voz alta y el modo de marquesina, ya que a veces es bueno dejar que el sistema lea en voz alta.”

El Dr. Kaplan dice que Spotlight text salió de la frustración que sentía en nombre de sus pacientes. “Ellos me decían que querían leer libros, pero no pudieron”, explica. “Muchos doctores recomiendan un circuito cerrado de televisión, un lector de escritorio que se pone el libro abajo y se mueve el libro como usted lo va leyendo. Pero es caro y difícil de usar. Las veces que lo he usado me dieron náuseas “.

Spotlight text cuesta $ 29.99, y está disponible en la tienda de iTunes, con $ 10 de la recaudación se destinará a una de varias organizaciones benéficas relacionadas con la visión.

Una suscripción en BookShare, que ofrece acceso ilimitado a sus títulos para las personas con discapacidad para la lectura de impresión, es de $ 50 para el primer año y $ 25 para los años siguientes. También hay una cuota de instalación por única vez de $ 25. El servicio es gratuito para los estudiantes en los Estados Unidos.

- See more at: http://www.blindness.org/blog/index.php/a-new-app-for-book-readers-with-low-vision/#more-3986

El mapa interactivo impreso en 3D ayudará a los discapacitados visuales a encontrar su camino.

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El mapa interactivo impreso en 3D ayudará a los discapacitados visuales a encontrar su camino.

El mapa interactivo 3D-impreso ayudar a los discapacitados visuales a encontrar su camino alrededor

 

Un nuevo tipo de mapa interactivo en 3D ha sido desarrollado para ayudar a las personas ciegas o con discapacidades visuales a encontrar su camino en lugares públicos como universidades o museos.

 

La tecnología ha sido desarrollada por la Universidad de Centro de Buffalo para el Diseño Inclusivo y Acceso Ambiental (Centro IDEA), en colaboración con la firma de investigación Touch Graphics Inc.

 

 

El proyecto ya se ha implementado en la Escuela Perkins para Ciegos en Massachusetts, el investigador del Centro de IDEA Heamchand Subryan considera que puede tener un impacto muy positivo.

 

“En realidad se trata de dar a esta audiencia, a esta población, una forma de entender su entorno”, dice. “Estamos proporcionando un nivel de información que les permita navegar en su entorno con facilidad, sin ayuda, lo que les da un sentido de independencia.”

 

Los mapas 3D utilizan pintura conductora para detectar la presión de las manos de un visitante. Como se tocan diferentes partes de la pantalla, el mapa anuncia nombres de edificios y direcciones, mientras que las características del paisaje como fuentes de agua están acompañados de efectos de sonido para proporcionar una experiencia más interactiva.

 

Mientras que la tecnología fue diseñada principalmente para ayudar a las personas con discapacidad visual, los mapas multisensoriales deben proporcionar una experiencia agradable para todos.

 

Los modelos, que son creados usando una impresora 3D, forman parte de una pantalla horizontal a diferencia de los mapas verticales a menudo se encuentran en los museos, lo que significa que se ajustan a la experiencia de la vida real del visitante más de cerca.

 

La instalación Perkins también cuenta con focos en los edificios cuando son tocados para iluminar el paisaje. Otras mapa prototipos 3D tendrán también su lugar en el Centro de Carroll para Ciegos en Massachusetts y Chicago Lighthouse for the Blind.

Read more: http://www.itproportal.com/2014/11/20/3d-printed-interactive-map-helping-visually-impaired-find-way-around/#ixzz3Jt3bdVEW

4 estrategias que los médicos están utilizando para curar a los ciegos.

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Rodrigo Lanzón.

Actualizado por Susannah Locke el 21 de noviembre de 2014.

Aproximadamente 40 millones de personas en todo el mundo están ciegas – y, durante mucho tiempo, la mayoría de las formas de ceguera eran condiciones permanentes. La misma situación tuvo lugar para las enfermedades degenerativas que afectan la vista.

Pero recientemente, los científicos han hecho algunos avances sorprendentes en cambiar eso. Nuevos tratamientos como la terapia génica, la terapia de células madre, y los implantes biónicos incluso ya están empezando a restaurar la vista de algunos pacientes. Y se espera que estas tecnologías para seguir mejorando en el futuro.

Tenga aquí un vistazo de todas las formas en que los científicos han intentado – y cada vez más, con éxito – la curación de los ciegos:

1) La terapia génica

Trabajando en los genes, es una vía prometedora para el tratamiento de la ceguera.

En 2011, un grupo liderado por Jean Bennett, de la Universidad de Pennsylvania utiliza la terapia génica para el tratamiento de algunos pacientes con un trastorno de la ceguera congénita. Los pacientes en cuestión tenían, todos, una enfermedad hereditaria llamada amaurosis congénita de Leber, y todos ellos tenían mutaciones en su gen RPE65. Los pacientes recibieron cada uno un virus no dañino que podría colarse con una copia sana del gen en sus células del ojo. Seis de 12 mostraron mejoría.

Luego, en 2014, los investigadores dirigidos por Robert MacLaren, un oftalmólogo en Oxford,  presentan algunos resultados preliminares prometedores de un pequeño  estudio de seis pacientes en distintas etapas de una rara enfermedad hereditaria llamada  coroideremia . Estos pacientes todos carecían de una proteína llamada REP1, lo que conduce a la pérdida progresiva de la visión. Los médicos tomaron el gen de la REP1, la pusieron en un virus no dañino, y que inyectan el virus a los ojos de los pacientes. Todos informaron una mejoría en su vista.

“Un paciente, que antes de su tratamiento no podía leer las líneas en una carta de ojo con el ojo más afectado, era capaz de leer tres líneas con ese ojo después de su tratamiento”,  escribió Susan Young Rojahn en el MIT Technology Review.

Tratamientos comerciales son todavía un largo camino, sin embargo. Los investigadores primero tienen que seguir vigilando a estos pacientes para ver lo que sucede a su visión a largo plazo (y detectar efectos secundarios). La FDA recomienda actualmente 15 años de control de la seguridad antes de tratar de obtener una terapia génica específica aprobada.

2) Las células madre

En lugar de arreglar las células existentes mediante la adición de genes, los científicos también podrían tratar de sustituir las células defectuosas o de las que están muertas. Las células madre teóricamente pueden ser inducidas a convertirse en cualquier tipo de célula del cuerpo, incluyendo, por ejemplo, las células especializadas de la retina.

En octubre de 2014, los investigadores de la empresa  Advanced Cell Technology (ahora llamado Ocata Therapeutics) publicaron un estudio de tres años en la revista The Lancet que demuestra que la adición de células de la retina derivadas de células madre embrionarias en el ojo había sido en gran medida segura para 18 pacientes y mejora de la visión en 10 de ellos. (Según un experto del MIT Technology Review, este proyecto tiene la distinción de ser el único en los Estados Unidos como un estudio de células madre embrionarias en las personas, aunque otros grupos están mostrando interés en iniciar ensayos similares.)

Algunos investigadores también están trabajando con células madre hechas a partir de las propias células de un paciente – llamadas células madre pluripotentes inducidas-(IPSC). Si esta técnica funciona, debería tener dos principales beneficios: soluciona los aspectos éticos de las células madre embrionarias, y el cuerpo del paciente no va a tratar de rechazar las células. En septiembre de 2014, investigadores de Japón  informaron que habían comenzado el primer experimento que involucra IPSCs en una persona. El pequeño estudio piloto en última instancia, la participación de seis pacientes y un seguimiento de su progreso a lo largo de varios años.

3) la visión biónica

Otra estrategia para el tratamiento de la ceguera es reemplazar las partes del ojo humano con los electrónicos.

En 2013, la FDA  aprobó el primer ojo biónico, y lo que realmente hace es dar un poco de vista a los ciegos. Llamado el Argus II, que es un implante ocular que pasa información de vídeo en tiempo real al cerebro, aunque con una resolución muy limitada y en escala de grises.

El Argus II implica una matriz de 60 electrodos que se implanta en el ojo para restaurar parte de su función. Una cámara montada en un par de gafas registra la información visual acerca del mundo. Esta información se analiza mediante una pequeña unidad de procesamiento de vídeo. Y entonces se transfiere de forma inalámbrica al implante situado en el  ojo, lo que activa las neuronas en la parte posterior del ojo y envía mensajes al cerebro.

El Argus definitivamente no puede llevar a la gente a una visión de 20/20. Pero ofrece una resolución suficiente para que la gente vea el contorno de una puerta, el movimiento de una persona, o las líneas en un paso de peatones. Algunos incluso han sido capaces de utilizarlo para  identificar las letras del alfabeto con unos pocos centímetros de altura. El Argus está actualmente aprobado por la FDA para las personas con retinosis pigmentaria, una enfermedad que afecta a más de dos millones de personas en todo el mundo.

Otros proyectos biónicos están también en el horizonte. Entre los más notables incluyen la investigación basada en la Universidad de Tübingen en Alemania que se ha producido un implante en el ojo que percibe la luz directa. En los ensayos clínicos, ha permitido al menos a un paciente leer letras grandes.

Otros proyectos, que está en las primeras etapas, implica implantes para el  cerebro en lugar de los ojos. La idea es aprovechar la dirección en la corteza visual, la región del cerebro que procesa la vista.

4) sustitución sensorial

Sustitución sensorial es una técnica completamente diferente. El objetivo no es restaurar la visión. Es el uso de otros sentidos como un sustituto.

Por ejemplo, algunas personas ciegas son capaces de utilizar la lengua para “ver” su entorno. Ellos hacen un sonido agudo con su lengua y escuchan atentamente a cómo el sonido se refleja en los objetos a su alrededor. Se trata básicamente de un sonar humano. (Cuando los animales hacen esto, se llama ecolocalización.) Daniel Kish, que ha sido ciega desde la infancia, puede ecolocalizar haciendo clic en su lengua. Usando esta técnica, se  dice que él puede ver objetos muy lejanos, siempre y cuando sean al menos del tamaño de una pelota de softball.

En 2011, un  estudio dirigido por David Whitney, de la Universidad de California en Berkeley encontró que seis ciegos ecolocalizadores experimentados tenían una precisión espacial que era “comparable a la encontrada en la periferia visual de las personas con deficiencia visual.”

Y en 2009, una colaboración de investigación entre ellos un grupo de la Universidad Politécnica de Valencia, España,  dio a conocer un casco que ofrece una experiencia de tipo sonar. Se necesita imágenes en tiempo real del mundo, los combina con los datos de profundidad de un telémetro láser, y presenta esa información como señales de audio a través de auriculares.

Proyectos similares han surgido en otros lugares, tales como el  SmartCane , que combina un bastón con un sistema de detección de ultrasonidos. Y en 2014, Amir Amedi, un neurocientífico de la Universidad Hebrea de Jerusalén,  introdujo el EyeCane, un dispositivo pequeño y portátil que utiliza dos rayos infrarrojos para detectar obstáculos cercanos y traducirlos a cualquier sonido o vibración. Era lo suficientemente intuitivo para requerir casi ningún entrenamiento, y la gente podría utilizar para detectar una puerta abierta a unos 15 metros de distancia.

Amedi es también uno de los varios investigadores que trabajan en proyectos que se traducen en imágenes breves como piezas musicales, a menudo referido como paisajes sonoros. Este tipo de software generalmente puede escanear una imagen de izquierda a derecha para crear un archivo de sonido corto. Cuanto mayor sea cada píxel que está en la imagen, se toca una nota con el tono más alto para representar a ese píxel.

En 2012, en la revista PLoS ONE , Amedi y sus colegas demostraron que las personas ciegas puedan usar el programa de paisaje sonoro de Peter Meijer para leer las cartas e incluso reconocer expresiones faciales – después de sólo unas decenas de horas de formación.